И т. д

В качестве доноров фосфатной группы ВР в реакции (2) могут принимать участие такие соединения, как ацетнлфосфат, L-фосфоаргннин, 4 фосфо-^-аспартат, карба мил фосфат, креатин-фосфат, 1,3-Дифосфо-О-глицерат, фосфоенолпируват, фосфор-амидат.

При использовании систем регенерации АТФ с участием фосфотра нефе раз удается осуществить практически полную регенерацию этого кофермента (с выходом более 95%).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Идеи иммобилизации биокаталиэаторов инициировали н стимулировали бурное развитие одного из важнейших направ­лении современной биотехнологии — инженерной энзимологни. Текущая (тактическая) задача инженерной энзимологин — это разработка (конструирование) биоорганических катализаторов с заданными свойствами на основе ферментов (в том числе с использованием пол я ферментных комплексов и даже целых кле­ток). Говоря о «заданных» свойствах, следует понимать, что они продиктованы потребностями практики; это, например» не­обходимое время службы катализатора при определенных усло­виях реакции (что зависит от его термостабильности, чувстви­тельности к тем или иным факторам среды), избирательность (специфичность) действия, производительность (каталитическая активность), иммуногенность, токсичность, геометрическая фор­ма препарата катализатора, его механические свойства и т. д.

Однако рамки инженерной энзимологни гораздо шире, чем создание катализаторов нового типа. Цель этой дисциплины, ее стратегическая задача состоит в том, чтобы разработать научные основы применения ферментативных катализаторов для создания новых биотехнологических процессов в промышлен­ности, новых методов в терапии н медицинской диагностике» анализе, органическом синтезе и в других областях практиче­ской деятельности.

В качестве примера, наглядно иллюстрирующего разработку новых подходов к решению практических задач инженерной энзнмологни с привлечением методов иммобилизации, может служить проблема применения биокатализаторов для проведения реакций органического синтеза в среде органических растворите­лей с низким содержанием воды. Дело в том, что широкое приме нение ферментов в органическом синтезе существенно ограничи­вается тем, что ферменты, как принято считать, способны эффективно функционировать лишь в среде с высоким содержа­нием воды, В то же время в классическом органическом синтезе в качестве реакционной среды нашли применение самые разнооб­разные органические растворители. Имеется несколько карди­нальных причин, которые делают необходимым использование органических растворителей как среды также и для фермента-

тивных реакций. Во-первых, при использовании органических растворителей решается проблема растворения гидрофобных реагентов, которая часто представляет трудно преодолимый барьер при проведении реакции в воде. Во-вторых, благодаря использованию органических растворителей термодинамическое равновесие многих ферментативных реакций сдвигается в сторо­ну требуемых продуктов. Прежде всего это относится к тем реак­циям, одним из продуктов которых является вода, в частности, к реакциям синтеза сложноэфирных, пептидных и амидных свя­зей. В-третьих, применение органических растворителей снимает проблему бактериального заражения технологических установок, которая весьма остро стоит при использовании водных раство­ров.

Благодаря этим очевидным преимуществам в последние годы обозначился резко возросший интерес к проблемам биокатализа в неводных средах. Были предложены многочисленные и разно­образные подходы, направленные на конструирование биоката­литических систем, способных функционировать с исключительно малым содержанием воды. С точки зрения круга проблем, обсуж­дающихся в данном пособии, важным является то, что эти подходы в подавляющем большинстве случаев основаны в той или иной степени на различных способах иммобилизации {физи­ческой или химической) биологических катализаторов.

Методические аспекты инженерной энзимологнн во многом определены иммобилизационными подходами. В этой книге были рассмотрены лишь основные принципы получения иммобилизо­ванных ферментов и влияние иммобилизации на свойства полу­чаемых препаратов- Поэтому главная цель пособия будет до­стигнута, если у читателя пробудится интерес к этому разделу биотехнологии и появится желание дальнейшего изучения затро­нутых вопросов.

В заключение отметим, что в целом иммобилизация (как инструмент биотехнологии) сама по себе является достаточно развитой в методическом отношении, в будущем здесь следует ожидать лишь детализации отдельных приемов, а наибольший интерес и перспективы связаны с ее практическим использо­ванием. И в этой связи хотелось обратить внимание, что идеи иммобилизации и ее методология приложимы не только к фер­ментам, но и многим другим соединениям, как высоко-, так и низкомолекулярным (гормонам, витаминам, лекарственным ве­ществам и т. п.)-

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИМЕРЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДИК

1. Иммобилизация три л си на на целлюлозе. 10 мл 6%-ного
раствора периодата натрия смешивают с 0,5 г целлюлозы. Пере­
мешивают смесь в течение 3 ч> затем осадок отделяют и промы­
вают водой. Промытый осадок помещают в 10 мл 0,1 М трисовогО
буфера, рН 6Д содержащего 10 мМ СаС1_й для уменьшения авто­
лиза, и добавляют фермент. Количество добавляемого трипсина
зависит от его удельной активности и, как правило, это 100 мг-
Смесь инкубируют при перемешивании в течение 1— 3 ч. Точное
время инкубации устанавливают экспериментально, определяя
удельную актшшость нативного трипсина и активность в супер-
натанте для расчета количества фермента, связавшегося с но­
сителем. Пробы для измерения активности супериатанта следует
отбирать в процессе иммобилизации через каждые 20—30 мин.
Полученный препарат иммобилизованного фермента отделяют
фильтрованием, промывают буферным раствором и насыщенным
раствором мочевины для удаления не связавшегося с носителем
фермента. Высушенный на фильтре препарат иммобилизованного
трипсина может храниться в течение нескольких месяцев при
4°С практически без потери активности.

2. Определение ферментативной активности иммобилизован­
ного трипсина. Определение проводят, измеряя скорость фермен-
тативного гидролиза этилового эфира Ы-бензоил-Ь-аргинина,
потенциометрически на рН-стате. Для этого из инкубационной
смеси отбирают пробы по 0,5—1,0 мл и помещают в ячейку
рН-стата, содержащую 10~³ М субстрата (рН около 7)_т 0,1 М
KCI и 10 мМ СаОг- Измеряют активность отобранных проб,
учитывая фоновую реакцию гидролиза субстрата в отсутствие
фермента.

3. Ковалентная иммобилизация u-хнмотрипсина в полиакрил-
амндном геле. Процедура иммобилизации включает две стадии:
модификацию хлорангидридом акриловой кислоты и включение
в гель.

а) К раствору 5—20 мг химотрипсина в 10 мл 0,2 М фосфат­ного буфера, рН 8,0, при 0°С добавляют 10—100 мкл хлорангид-рида акриловой кислоты порциями по 10 мкл при интенсивном

перемешивании. После добавления каждой новой порции хлор-ангидрида акриловой кислоты инкубируют раствор в течение 5 мин, доводят рН до 8,0, добавляя концентрированный раствор КРН: затем вносят новую порцию модификатора. После завер­шения модификации раствор инкубируют при 0°С без перемеши­вания в течение 30 мин.

б) К раствору модифицированного фермента (10мл) после­довательно добавляют 3*33 г акриламида, 0,2 г N,N'-метилен-бис-акрил амида и 0,1 мл 10%-ного водного раствора N_TN,N',N'-тетраметилэтилендиамина, доводят рН до -8,0 концентрированной НС1 и далее добавляют 20 мг персульфата аммония в виде 20%-ного раствора. Раствор быстро (в течение нескольких се­кунд) перемешивают, разливают в тонкостенные стеклянные пробирки диаметром 5 мм и инкубируют в течение суток при 4°С. Полученный гель извлекают из пробирок, измельчают, растирая в ступке, и инкубируют в течение суток в 0,1 М трисовом буфере, рН 8,0, при 20°С. Суспензию переносят на стеклянный фильтр G-2 (пор-100), промывают несколькими объемами дистиллиро­ванной воды, высушивают гель на фильтре в течение нескольких минут. Удельная активность иммобилизованного а-химотрипсина составляет 0,1—0,3 мг фермента на I г геля.

4, Определение активности иммобилизованного а-химотрипси-
на„ Определение проводят потенциометрически, измеряя скорость
ферментативного гидролиза специфического субстрата этилового
эфира N-ацетшг-L-тирозина на рН-стате. Для этого навеску
иммобилизованного фермента (0,05—1,0 г) помещают в ячейку
рН-стата с 5—10 мл 5 мМ раствора субстрата в 0,1 М КС1
(рН 8,0) н измеряют активность препарата фермента, учитывая
фоновую реакцию гидролиза субстрата в отсутствие фермента.

5. Реактивация термоинактивированного иммобилизованного
трипсина. Препарат иммобилизованного трипсина (0_т2—1 г)
после термоинактивации (остаточная активность 5—15% от
уровня активности препарата фермента до термоинактивации)
вносят в 4 мл раствора 10 М мочевины (рН 3) и инкубируют в
течение 30 мин. Затем доводят рН до 8,5 концентрированным
раствором КОН и в суспензию добавляют 1 мл 0,t M раствора
трисового буфера (рН 8,5), содержащего 10 мг дитиотреитола —
реагента, расщепляющего S—S-связи в белках. Суспензию ин­
кубируют в течение 3 ч при 20°С в атмосфере инертного газа
(азота или аргона). После инкубации препарат иммобилизован­
ного трипсина переносят на стеклянный фильтр G-3 (пор-40) и
промывают 1 мМ раствором НС! и 5%-ным раствором уксусной
кислоты несколько раз порциями по 10—20 мл до исчезновения
запаха дитиотреитола. Промывание препарата проводят в токе
инертного газа, ее продолжительность не превышает 10—15 мин.
Затем препарат помещают в 10 мл 0,1 М раствора трисового
буфера (рН 8,0), содержащего 10 мг ЭДТА и смесь глутатионов:
12 мг восстановленной формы и 2,4 мг окисленной формы. Инку­
бацию иммобилизованного препарата в этих условиях проводят

в течение 1—2 сут при 20°С При этом происходит реактивация иммобилизованного трипсина на 70—100% от уровня исходной (до иммобилизации) активности фермента.

6. Микрокапсулнрование ферментов в полупроницаемые най~ лоновые оболочки методом межфазной полимеризации. К 0,75 мл 10%-ного раствора полиэтиленимина, рН которого доведен до 9,8, добавляют 0,75 мл 0,38 М раствора 1,6-гексаметилендиамнна в 0,8 М карбонатном буфере, рН 9,8. Раствор перемешивают, охлаждают до 0^уС, растворяют в нем 15 мг и-химотрнпснна. К полученному 1%-ному водному раствору фермента в тефлоно-вом стаканчике объемом 100 мл, помещенном в ледяную баню, добавляют 7,5 мл охлажденной смеси хлороформа и циклогекса-на (1: 5 по объему), содержащей 1% по объему эмульгирующего агента Спан-85. Эмульгируют водный раствор фермента в орга­ническом растворителе на магнитной мешалке при 0°С в течение 1 мин. Размер капсул определяется скоростью перемешивания и концентрацией Спан-85 — стабилизатора эмульсии.

К полученной эмульсии типа «вода в масле», не прекращая перемешивания, добавляют 7,5 мл охлажденного 18 мМ раствора себацнлхлорида в вышеназванной смеси органических раство­рителей. Раствор себаци л хлорида готовят непосредственно перед употреблением путем растворения 0,03 мл дихлорида в 7,5 мл смеси растворителей. В результате диффузии 1,6-гексаметилен-днамнна из волной в органическую фазу на поверхности раздела фаз образуется полимерная мембрана. Реакцию образования по­лимерной мембраны на поверхности эмульсионных капелек про­водят в течение 3-^5 мин при перемешивании. Для прекращения реакции полимеризации к суспензии микрокапсул добавляют 15 мл вышеназванной смеси органических растворителей.

Полученную суспензию микрокапсул разливают в две центри­фужные пробирки и добавляют в каждую по 10 мл 15%-кого рас­твора Спан-85 в смеси хлороформа н циклогексана в объемном соотношении 1:3. Суспензию перемешивают палочкой и центри­фугируют при 8000 об/мин в течение I—2 мин, супернатант уда­ляют.

Микрокапсулы диспергируют в 15 мл 50%-кого водного рас­твора Твнн-20 на магнитной мешалке в течение 1 мин при макси­мальной скорости перемешивания. К полученной суспензии пор­циями добавляют 130 мл воды при перемешивании на магнитной мешалке в 0,5 л стеклянном стакане {по мере добавления воды постепенно снижают скорость перемешивания).

Суспензию центрифугируют при 8000 об/мин в течение 2— 3 мин. Супернатант удаляют, микрокапсулы промывают раство­ром НО, рН 3,0, до исчезновения ферментативной активности в фильтратах. Полученные микрокапсулы хранят в виде суспензии в 1 мМ НС1 при 4^СС. Размеры полученных микрокапсул 10— 15 мкм.

7. Ми крокапсулнро вание ферментов в поликарбонатные обо­лочки методом двойного эмульгирования. К Юмл 10%-ного

шта в метилен хлориде при интенсивном перемешивании быстро по каплям добавляют 2 мл 1%-ного вод­ного раствора фермента {рН 3,0), содержащего 5% полиэтилен-амина. Эмульгирование проводят в течение 1 мин. К полученной первичной эмульсин, не прекращая перемешивания, постепенно приливают 50 мл 2%-ного раствора поливинилового спирта — стабилизатора эмульсии в 0,5 JVL ацетатном буфере, рН 4 J. Про* должают перемешивание в течение 2,5—3 ч при комнатной тем­пературе. За это время метилен хлорид полностью испаряется, н на поверхности водных капелек фермента образуется твердая полупроницаемая полимерная оболочка- Микрокапсулы отделяют и промывают 1 мМ раствором HCI на воронке со стеклянным пористым фильтром.

8. Солюбилнэация ферментов в обращенные мицеллы поверх­
ностно-активных веществ в органических растворителях. К 2 мл
0,1 М раствора Аэрозоля ОТ в октане добавляют 5—150 мкл
10—50 мМ водного буферного раствора, рН 3—11 (концентрация
не должна превышать 50 мМ, при наличии высокой ионной силы
следует использовать буферный раствор с более низкой концен­
трацией). Смесь интенсивно встряхивают до образования опти­
чески прозрачного раствора. Для ускорения процесса образова­
ния прозрачного раствора, содержащего большие количества
буферного раствора, добавляют буферный раствор порциями по
2—3% (40 -G0 мкл). Далее добавляют Б— 20 мкл водного
раствора фермента и опять интенсивно встряхивают до образо­
вания оптически прозрачного раствора. Фермент можно вносить
н в виде навески сухого обессоленного порошка, однако время
растворения фермента в этом случае в системе обращенных
мицелл с низким содержанием воды (меньше 2%) существенно
увеличивается (от нескольких десятков секунд при внесении
водного раствора белка до десятков минут и даже часов
при внесении сухого белка). Для солюбнлизации белка и опре­
деления активности включенного фермента наиболее широко
используются растворы Аэрозоля ОТ в октане в концентрациях
от 30 до 300 мМ,

9. Получение нанегранулированного смшмотрипсина. К 5 мл
0,235 М раствора Аэрозоля ОТ в толуоле добавляют 100 мг
акриламнда н 25 мг Ы,Ы'-метнлен-бнс-акриламнда в 200 мкл
воды и инициатор радикальной полимеризации, азо-бис-изобу-
тиронитрил, из раечсти О, i мг/мл Смесь встряхивают в течение
15—30 мин до полной солюбилизацни. Затем к полученному
раствору добавляют 100 мкл концентрированного (0,5 мМ) вод­
ного раствора акрнлоилнрованного сс-хнмотрнпсина (см. его
получение в примере 3) и после встряхивания получают одно­
родный прозрачный раствор обращенных мицелл Аэрозоля ОТ
в толуоле, содержащий солюбилизованные мономеры.

Полимеризацию инициируют облучением деаэрированного мицеллярного раствора УФ-светом (ксеионовая лампа ХВО-200, расстояние от источника 33 см, толщина слоя раствора 1см).

Для завершения полимеризации облучение продолжают в тече­ние 10 мин.

После проведения полимеризации мнцеллярную систему раз­рушают добавлением 10-кратного избытка ацетона. При этом по­лимерные наногранулы (размер менее 100 нм в диаметре) выпа­дают в осадок, а растворимые в ацетоне непрореагировавшие мономеры и Аэрозоль ОТ удаляют с супернатантом. Полученный сухой порошок наногранулированного а-хнмотрипснна обладает до 40—60% ферментативной активности (от исходной), может храниться практически без потери активности в течение полугода при 4°С, растворим как в воде, так и в мицеллярных растворах в органических растворителях.

10, Гидрофобнзацнн белков (на примере сс-хнмотрипснна) для целей нековалентной иммобилизации на гидрофобных носителях (биомембранах). К 10 мл 0,1 М раствора Аэрозоля ОТ в октане добавляют 450 мкл 33 мМ боратного буфера, рН 9,0. Раствор интенсивно встряхивают в течение I—2 мин, солюбнлизуют в нем 20—50 мг препарата лиофилизованного фермента, затем добав­ляют —100 мкл раствора стеароилхлорида в 0,1 М Аэрозоле ОТ в октане (соотношение стеароил хлорид — белок составляет 2:1). Раствор перемешивают в течение 20—30 мин,

Из реакционной системы белок осаждают на холоду добавле­нием двойного объема ацетона, выпавший осадок белка отделяют и встряхивают с 20 мл холодного ацетона для отмывки от приме­сей октана и Аэрозоля ОТ. Эту операцию повторяют 2—3 раза. Остаток ацетона удаляют на роторном испарителе (18°С) или током воздуха. Выход по белку контролируют по массе н спектро-фотометрнческн (280 нм).

Фракционирование стеароилированного химотрипсина прово­
дят на колонке (объем 210 мл) с сефядексом G-50, уравновешен­
ным I мМ НС1. И-л колонку наносят 10—20 мл 20 мкМ раствора
белка» рН ЗД Гидрофильную фракцию элюируют I мМ HCl_t
гидрофобную — 0,5%-ным раствором Бридж 35, рН ЗД Выход
модифицированного белка составляет %

ЛИТЕРАТУРА

Основная:

Введение в прикладную энзимол огню/Под ред. И. В. Березина и К. Марти-неха. — М.: Изд-во МГУ, 1962. 384 с.

Иммобилизованные ферменты //Современное состояние и перспективы /Под ред. И В. Березина, В. К. Антонова и К. Мартннека.— М.: Изд~во МГУ, 1976, Т. U 2. 296 с: 358 с.

Тривен М. Иммобилизованные ферменты.—М.: Мир, 1983. 213 с.

Лурье А. А. Хромат о графические материалы. ■— М.: Химия, 1978.

Коршак в. В., Штильман М. И. Полимеры в процессах иммобилизации модификации природных соединений. — М.: Наука, 1984. 261 с.

Handbook of Enzyme Biotechnology Ed by A. Wiseman 2-nd edition — Chichester: John Witey and Sons, 1985, 437 p.

Methods in Ensymotogy//Immobilized Enzymes/Ed by K. Mosbch, — New York: Academic Press, 1976. Vol. 44, 999 p.

Rosevear A. Immobilized biocataly&ts— a critical review//J. Chem. Techno]. Biotechnol. 1984. 34 B. P. 127—150.

Gtazer A. N. The chemical modification of proteins by groupspeciHc and site-specific reagents//In: The Protein. (H. Neurath, R. L. HiU, Eds). — New-York. Academic Press, 1976. VoL 2. P. 1-103.

Дополнител ъ «ал:

Береэин И, fl., Мартинек К. Основы физической химии ферментатив­ного катализа. — М.: Высшая школа, 1977. 280 с.

Курганов Б. И. Алл остер нческие ферменты. — М.: Наука, 1978. 248 с.

Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. — М.: Наука, 1985. 536 с.

Поверхностные явления и поверхностно-активные вещества/Под ред. А. А. Абрамэона и Е. Д. Щукина. — М.: Химия, 1984. 392 с.

Мартинек К., Березин И, В, Стабилизация ферментов — ключевой фактор при внедрении биокаталнэа в практику //Успехи химии. 1980. Т. 49. С. 737—770.

Можаея В. R. Иммобилизации ферментов как новый подход к решению фундаментальных проблем энзимологни//Успехи биологической химии. 1983. Т. 24. С 99—134.

Хмельницкий Ю. Л., Левашов А. В., Ка&чко И. Л., Мартинек К- Микро­гетерогенная среда для химических (ферментативных) реакций на основе коллоидного раствора ноды в органическом растворителе//Успехи хиадин. L984. Т. 53. С. 54В 5G5.

Мартинек /(-, Левашов А. В., Каячко И. Л„ Хмельницкий Ю, Л., Бере­эин И. В. Мицеллнрнан энэимологня. Бнол. мембраны. Т. 2. 1985. С. 669—696.

Исторический очерк

Ьиокаталнз//Истории моделирования опыта живой при роди /Церезин И. В., Кузнецов В. И, Варфоломеев С. Д. и др. М.: Наука, 1981. 344 с.

ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ

Автолиз 121, 122