Компоненти середовища

Найчастіше для культивування калюсної і суспензійної культур використовують середовище Мурасиге і Скуга (МС). Це середовище підтримує ріст більшості клітин рослин, а також оптимальне для індукції вторинних метаболітів у цих клітинах. В основному умови середовища, які обмежують швидкість поділу клітин, підтримують активний синтез вторинних метаболітів і їх накопичення в культурах клітин.

Найвпливовішим фактором живильного середовища є регулятори росту: змінюючи концентрації або складовий набір гормональних речовин, можна суттєво впливати на процеси синтезу. Наприклад, при заміні 2,4–Д на НОК у середовищі для вирощування суспензійної культури Morinda citrifolia отримали збільшення синтезу алколоїду антрахінону у 3 рази. Подібні результати отримані для тютюну: спостерігали синтез нікотину на середовищі з ІОК, але не з 2,4–Д у тій же концентрації. НОК, залежно від концентрації, мала стимулюючий або інгібуючий вплив на біосинтез нікотину в культурах клітин тютюну. Отже, 2,4-Д менше прийнятна для запуску вторинного метаболізму в культурах рослинних клітин, ніж ІОК.

У більшості випадків ауксини додають до середовища разом із цитокінінами. Цитокініни по різному впливають на накопичення вторинних метаболітів. У культурах клітин Scopolia maxima відносно висока концентрація кінетину (5·10^-5 М) викликає утворення алкалоїдів, тоді як в калюсних і суспензійних культурах N. tabacum кінетин в концентраціях вищих 5·10^-5 М повністю пригнічував утворення нікотину.

Важко оцінити спільну дію ауксинів і цитокінінів на утворення вторинних метаболітів, особливо у зв’язку з тим, що не має даних про відносний вміст цих регуляторів росту у клітинах, що культивуються. Вивчення впливу регуляторів росту на біосинтез стероїдів у культурах Solanum aviculare, показало, що ауксин у порівнянні з цитокініном сильніше впливає на вихід стероїдів і ріст біомаси навіть при додаванні цитокініну в різних концентраціях.

Мінеральні солі. Підвищення вмісту нітратів, калію, амонію і фосфату приводить до підтримки швидкого росту клітин, тоді як виснаження або відсутність деяких із цих живильних речовин стає фактором, який лімітує ріст і супутній вторинний синтез. Недостача фосфату у більшій мірі, ніж будь-яких інших живильних речовин, стимулює синтез вторинних метаболітів. Наприклад, біосинтез нікотину у культурах тютюну пов’язаний з виснаженням фосфату в живильному середовищі і зі зменшенням вмісту інших живильних речовин, таких як нітрат і сахароза.

На накопичення біомаси впливає вуглеводневе живлення. Для більшості культур використовують сахарозу у концентраціях 15-30 г/л. Використання підвищених концентрацій сахарози (3-5%) звичайно приводить до збільшення виходу вторинних метаболітів у культурах.

Попередники. Додавання у середовище попередників для підвищення виходу кінцевого продукту не набуло широкого використання. Основною перепоною для використання попередників є недостатнє вивчення шляхів біосинтезу багатьох речовин вторинного синтезу.

Оптимізація живильного середовища є ключовим фактором у підвищенні виходу продукту. Дослідження впливу живильних середовищ на вихід продукту привели до розробки так званих „продукційних середовищ”, із яких найбільш відоме середовище Ценка. Основна особливість продукційних середовищ – можливість створювати умови для низької швидкості росту при незначній або повній відсутності поділу клітин для підвищеного виходу продукту.

Фізичні фактори

На синтез вторинних метаболітів культурами рослинних клітин впливає інтенсивність і довжина хвилі світла. Освітлення люмінісцентними лампами типу “холодне біле світло” (250 люкс) стимулює біосинтез багатьох вторинних метаболітів, наприклад, стероїдні сапогеніни, стероїдні алкалоїди та інші. Для більшості культур індукуючу дію має світло з піками 372 нм і 438 нм.

Відомості про температурний оптимум для росту культур клітин і утворення вторинних метаболітів в цих культурах дуже обмежені. Мабуть це обумовлене традиційним підходом, коли дослідження in vitro проводять при температурі близько 25⁰ С.

Селекція і відбір

У клітинній популяції, одні клітини синтезують значно більші кількості речовини, ніж інші. Селекція і відбір клітин-продуцентів дозволять одержати клітинні лінії, які перевищують рівень біосинтезу вторинних метаболітів вихідної клітини. Там, де продуктом є пігмент, відбір можна проводити за допомогою мікроскопа або і візуально виявити інтенсивно забарвлені окремі клітини або групи клітин.

Запропоноване в 70-ті роки минулого століття використання радіоімунодіагностики (РІД) підвищило ефективність відбору клітин-продуцентів.

Сьогодні перевага надається використанню ферментної імунодіагностики (ЕЛАЙЗА). Необхідність використання таких складних систем відбору обумовлена труднощами при визначенні дуже низьких концентрацій метаболітів.

Отже, створивши сприятливі умови культивування, in vitro можна отримати вторинний метаболіт у кількостях, які синтезуються in vivo, а іноді і вищих. Тому сьогодні культуру клітин рослин розглядають як технологію для отримання цінних сполук, які потрібні у невеликих кількостях.

Утворення вторинних речовин в культурах рослинних тканин