Гібридизація

Ізольований протопласт – це рослинна клітина, позбавлена клітинної стінки ферментативним або механічним способом.

Культура ізольованих протопластів це один із найсучасніших методів, який використовується у генетиці, фізіології, вірусології і молекулярній біології для отримання соматичних гібридів між віддаленими у систематичному відношенні видами або у разі статевої несумісності, для отримання нових форм рослин шляхом введення у клітину чужорідного геному або його частини.

Відсутність оболонки полегшує надходження у клітину різних фізіологічно активних речовин і дозволяє спостерігати за первинною реакцією клітини на вплив цих речовин, досліджувати метаболізм у контрольованих умовах. Так як в ізольованих протопластах одразу починається регенерація клітинної оболонки, то вони є дуже зручним об’єктом для вивчення формування целюлозних мікрофібрил.

Протопласти вищих рослин можна отримувати механічним і/або ферментативним методом.

Вперше протопласти були виділені Клеркером у 1892 році при вивченні плазмолізу із тканин листка водяної рослини тілоріз (Stratiotes aloіdes). Він спочатку плазмолізував рослинні тканини, а потім видаляв клітинну стінку. Таким методом можна виділити протопласти із епідерми цибулі (в 0,1 М розчині сахарози). Якщо після плазмолізу розрізати лезом смужку епідерми, то протопласти будуть виходити в середовище, яке містить осмотичний стабілізатор. Такий метод виділення протопластів називаються механічним, або фізичним.

Незважаючи на модифікації і вдосконалення механічний метод і сьогодні має певні обмеження:

1) цим методом можна виділити тільки невелику кількість протопластів;

2) використовуються тільки ті тканини, в яких відбувається інтенсивний плазмоліз, тобто ті які мають вакуолізовані клітини паренхімного типу;

3) метод тривалий і трудомісткий, а тому зараз використовується дуже рідко.

Сьогодні широко застосовується ферментативний, або хімічний метод виділення ізольованих протопластів. У цьому випадку для руйнування клітинної стінки використовуються суміші ферментів. До перших робіт по ферментативному виділенню протопластів можна віднести досліди, в яких протопласти клітин гриба були ізольовані в результаті обробки клітинних стінок шлунковим соком слимака Helix pomatia (1919).

Вперше протопласти із клітин вищих рослин ензиматичним методом виділив Кокінг у 1960 році. Він виділив протопласти із корінців проростків томатів, обробляючи їх гідролітичним ферментом (целюлазою) із культуральної рідини пліснявих грибів Myrothecium verrucaria.

Ферментативний спосіб має великі переваги, бо він дає можливість отримувати значні кількості непошкоджених протопластів із будь-якого органа чи тканини, і порівняно швидкий.

На сьогодні протопласти отримують із однодольних і дводольних рослин, використовуючи листки, пагони, колеоптилі, бульби, плоди, пилок, калюсні культури.

Для виділення протопластів, як правило, використовують молоді рослини. Перевага надається рослинам, які виросли у стерильних умовах in vitro. У дослідженнях ряду авторів (Хромова и др., 1984; Chaoxi et al., 1987; M.C. Tan et al., 1987) показано, що на життєздатність ізольованих протопластів, та їхню здатність до регенерації клітинної стінки, до поділів, утворення мікроколоній впливає фізіологічний стан вихідного матеріалу, який визначається умовами культивування. Крім того, від фізіологічного стану вихідного матеріалу залежала здатність тканини до мацерації. Найкращі результати були отримані при вирощуванні рослин на середовищі зі зменшеним вмістом сахарози (0,5 %) і затемненні рослин перед виділенням протопластів. Або при вирощуванні вихідних рослин при низькій інтенсивності світла (1500 – 2000 Лк) і короткому фотоперіоді (6 г). Дослідники пояснюють збільшення кількості життєздатних протопластів тим, що при слабкому освітленні або на середовищі з низьким вмістом сахарози різко знижується інтенсивність фотосинтезу, в результаті чого зменшується вміст вільних цукрів і клітини синтезують тоншу клітинну стінку, яка містить менше пектину. Щодо значення або впливу вирощування вихідного матеріалу при низьких плюсових температурах на вихід ізольованих протопластів, то дані протилежні: M.C. Tan (1987) відмічає збільшення кількості ізольованих протопластів за таких умов, тоді як Хромова із співр. (1984) зазначають, що зниження температури в період культивування вихідних рослин не приводило до підвищення ефективності процесу отримання життєздатних протопластів, що активно діляться.

При виділенні протопластів із культури тканин (калюс або клітинна суспензія) необхідно враховувати:

1) вік вихідної тканини у циклі вирощування: краще використовувати тканину, що перебуває на стадії раннього експоненціального росту, коли у популяції значна кількість клітин, які здатні почати поділ;

2) особливості росту тканини – для виділення протопластів краще використовувати пухку, недиференційовану тканину, яка утворює невеликі агрегати клітин при культивуванні у рідкому середовищі.

Важливе значення для успішного виділення життєздатних, нативних протопластів має підбір осмотичного стабілізатора. З наявністю клітинної стінки у рослинної клітини пов’язана регуляція її водообміну. Як відомо, сисну силу формують не лише осмотичні властивості клітини, але і тургорний тиск. Зі збільшенням кількості води у клітині зростає тургорний тиск і, відповідно, зменшується її сисна сила. Процес надходження води у клітину припиняється повністю, коли тургорний тиск стає рівним осмотичному тиску. Таким чином, структурна організація клітини, яка включає протопласт і клітинну стінку, формує саморегуляторний механізм водообміну.

Тому для ізольованих протопластів, позбавлених клітинної стінки особливе, дуже важливе значення мають осмотичні властивості середовища виділення і культивування. Як осмотичні стабілізатори використовують цукри – глюкозу, сахарозу, маніт, сорбіт, ксилозу і іноді іонні осмотики – розчини солей СаCl₂, KCl, Na₂HPO₄. Маніт використовують частіше, ніж сорбіт так як він має слабку проникну здатність у клітини, проникнення у клітини сорбіту супроводжується і проникненням ферментів. Використовують суміш маніту і сорбіту. Використання у ферментних системах розчинів глюкози і сахарози створює умови близькі до умов культивування, хоча ці цукри активно проникають через мембрану. У тих випадках, коли використання цукрів не дає хороших результатів, як осмотичні стабілізатори використовують розчини солей. Хоча відомо, що солі мають більшу проникну здатність, ніж цукри, і знижують активність деяких гідролітичних ферментів. Розчини макро- і мікросолей часто беруть за основу до якої додають інші фізіологічно активні речовини. Це пом’якшує процес виділення протопластів. Особливо коли він тривалий, і наближає його до умов культивування тканини у суспензії. Неправильний вибір осмотичного агента може привести до розриву плазмалеми або спричинити спонтанне злиття протопластів і утворення багатоядерних клітин. Оптимальним для виділення протопластів є 0,3 – 0,8 М розчини.

Для ферментативного руйнування клітинної стінки використовують препарати трьох типів – целюлази, геміцелюлази і пектинази, які отримують із культур різних грибів (Myrothecium verrucaria, Trichoderma viride, Aspergillus та інші), а також травного соку слимака Helix pomatia. Найчастіше використовують целюлазні препарати “ Onozuka ”, “ Driselase ” і препарати пектинази – “ Macerozyme ”, “ Pectinase ” або “ Pectinol ”. Дія цих ферментів направлена на руйнування основних компонентів клітинної стінки. У рослин це целюлоза, геміцелюлоза і пектинові речовини. Целюлозні молекули, які зібрані у мікрофібрили, формують пухкий, але міцний структурний остов. Він занурений у аморфний матрикс, який складається із геміцелюлоз, пектинових речовин і білків.

У первинній клітинній стінці на долю целюлози припадає до 30 % від сухої маси і стільки ж на пектинові речовини, 40 % становлять геміцелюлози. Ці співвідношення можуть варіювати у клітинах різних типів тканини залежно від функціональних особливостей, віку, наявності вторинних потовщень. Тому комбінації ферментних препаратів і їх співвідношення специфічні для кожного типу клітин. Так для отримання протопластів із тканини плодів, які як правило мають високий вміст пектину, особливо підходить пектиназа. Тоді як, при виділенні протопластів із мезофілу листка слід використовувати суміш пектинази і целюлази – ферменту, що руйнує целюлозні компоненти клітинної стінки.

Оптимальні умови для виділення протопластів дуже індивідуальні для різних тканин, а тому у кожному випадку необхідно підбирати склад суміші ферментів, їх концентрації і співвідношення, а також тривалість обробки. Виділені протопласти повинні контактувати з ферментом мінімальний час, а потім їх треба ретельно відмити.

Час виділення протопластів залежить від концентрації ферменту. При великих концентраціях тривалість інкубації становить 1 – 4 год, при невисоких – 12 - 20 год, оптимальні умови рН 5 – 6, температура 23 – 26 °С. Іноді необхідне слабке покачування протягом інкубації з ферментом.