Клітинна селекція

Клітинна селекція – один із важливих напрямків в біотехнології рослин. Відбір клітинних ліній і рослин з цінними спадковими ознаками відбувається на рівні клітин, що культивуються in vitro в селективних умовах. Основною перевагою клітинної селекції є можливість маніпулювати з мільйонами клітин, проводити направлену селекцію в чашках Петрі і регенерацію рослин. Отримання рослин із відібраних у селективних умовах клітин можливе завдяки унікальній властивості рослинних клітин – тотипотентності.

Для проведення клітинної селекції використовують такі прийоми:

- пряма (позитивна) селекція, при якій виживає певний мутантний тип клітин;

- непряма (негативна) селекція, яка базується на вибірковій загибелі клітин дикого типу, які діляться, і виживанні метаболічно неактивних клітин, але потребує додаткової ідентифікації у них мутаційних змін;

- ступінчата, або поступова селекція, при якій концентрацію токсичної речовини підвищують поступово. Як правило селекцію починають з концентрації, яка викликає загибель 50 % клітин;

- тотальна селекція, при якій індивідуально тестуються усі клітинні клони;

- візуальна селекція і неселективний відбір, коли варіантна лінія може бути ідентифікована серед всієї популяції клітин візуально або при використанні біохімічних методів (тонкошарова або рідинна хроматографія, радіоімунний аналіз, мікроспектрофотометрія та інші).

Із перерахованих вище прийомів клітинної селекції найчастіше для відбору різних мутантів використовують пряму селекцію. Цей метод використовують для виділення мутантів стійкості, наприклад до гербіцидів, антибіотиків, токсинів, важких металів тощо.

При селекції цих мутантів у кожному випадку необхідно визначати селективні концентрації токсичних речовин. У більшості випадків вміст токсичних речовин не повинен бути значно вищим того, що інгібує ріст тканин. У цілому схему прямої селекції через ізольовані протопласти можна представити так:

1. виділення протопластів;

2. обробка мутагеном (не обов’язкова);

3. культивування в неселективних умовах (3 – 5 поділів ≈ 10 – 14 днів);

4. культивування на селективних середовищах;

5. культивування на регенераційних середовищах (краще з селективним агентом);

6. егенерація рослин і їх розмноження (тести на стійкість, біохімічний аналіз);

7. висадка рослин у ґрунт;

8. тестування на стійкість насіння.

Для проведення робіт по клітинній селекції в умовах in vitro як вихідний матеріал можуть бути використані калюсні і суспензійні культури, ізольовані протопласти, органи: пилок, насіння, зародки, листки, меристеми, сегменти стебла, пагони.

Вибір об’єкта залежить від міри розробленості методик і технологій стосовно різних видів рослин, а також від кінцевих цілей дослідження.

Калюсна тканина – це найбільш доступний матеріал, який часто використовують для селекції in vitro. Використовують, як правило, свіжовиділену тканину або ту, що культивується, але не втратила регенераційну здатність. Саме через культуру калюсної тканини вперше виділені лінії тютюну стійкі до стрептоміцину, токсинстійкі мутанти кукурудзи.

Однак при роботі з калюсними тканинами є ряд суттєвих недоліків:

- відносно повільний ріст тканини;

- нерівноцінний для всіх тканин ефект мутагенів, а також селективних речовин;

- ідентифікація окремих стійких клітин може ускладнюватися їх маскуванням не мутантними клітинами;

- ріст стійких клітин може пригнічуватися мертвими клітинами;

- поряд зі стійкими можуть виживати чутливі клітини, які контактують з мутантними;

- культивованим тканинам характерна генетична нестабільність і втрата регенераційної здатності.

Проте не зважаючи на ці недоліки використання калюсних тканин, для багатьох видів рослин ефективні технології та способи культивування одиночних клітин ще не розроблені, і даний вихідний матеріал для селекції мутантів in vitro залишається найбільш придатним.

Велику кількість робіт по культивуванню калюсу, з метою отримання нового селекційного матеріалу, проведено на пшениці, ячмені, рисі, сорго, картоплі, томатах, люцерні і дуже рідко на деревних. Уже досягнуто перші позитивні результати по отриманню рослин пшениці, рису, картоплі, стійких до NaCl або Na₂SO₄. Шляхом додавання в живильне середовище токсичних аналогів амінокислот отримані клітини, а з них рослини моркви, які синтезують у 20 разів більше метіоніну, в 30 разів – триптофану, в 5 разів – лізину. Отже, використання калюсної культури в селекційних цілях відкриває величезні можливості у створенні нових форм рослин, які несуть цінні ознаки, необхідні для людини.