Мета роботи: оволодіти методикою виділення і культивування протопластів із мезофілу листка; отримати ізольовані протопласти із мезофілу листка рослин картоплі.
Матеріали і обладнання: асептичні рослини картоплі, ферментні препарати - Cellulysin, Macerase, Driselase, глюкоза, сахароза, ксилоза, манітол, CaCl2·2H2O, NaCl, KCl, NH4NO3, KNO3, MgSO4·7H2O, KH2PO4, NH4Cl, FeSO4·7H2O, Na2ЕДТА·2H2O, H3BO3, MnCl2·4H2O, ZnSO4·7H2O, CuSO4·5H2O, CoSO4·7H2O, KI, Na2MoO4·2H2O, мезоінозит, гліцин, нікотинова кислота, фолієва кислота, біотин, аденін сульфат, гідролізат казеїну, тіамін, піридоксин, ІОК, НОК, 2,4-Д, БАП, зеатин, 1N KOH, агар, стакани на 200 мл, мірні циліндри, мірні піпетки, пастерівські піпетки, чашки Петрі діаметром 60 мм і 100 мм, колби Ерленмейера на 250 мл і 50 мл, колбочки зі скляними лійками і нейлоновими фільтрами (діаметр пор 50-100 мкм), центрифужні пробірки з гумовими пробками, шприц з насадкою з фільтрами “Millipore” з діаметром пор 0,22 мкм або 0,45 мкм, стерильний фільтр Зейтца, ваги, шпателі, пінцети, скальпелі, лезо у держаку, магнітний змішувач, рН-метр, настільна центрифуга, інвертований мікроскоп, плитка, автоклав, ламінар-бокс, спиртівка, вата, фольга, спирт, парафілм.
ХІД РОБОТИ
Робота складається з кількох етапів.
Етап 1. Підготовка до досліду.
1. Приготувати середовище виділення протопластів SI: 0,5 М розчин сахарози з 5 мМ CaCl2.
2. Приготувати середовище W-5 для відмивання протопластів (табл. 16).
3.Приготувати середовище W-S-S для культивування мезофільних протопластів картоплі (табл. 16).
Для культивування мезофільних протопластів тютюну використовують середовище К-3 (табл. 16).
4. Приготувати середовища ST-1, ST-2 і ST-3 (табл. 16).
Для регенерації рослин тютюну використовують середовище RMOP (табл. 16).
5. Простерилізувати середовища.
6. Простерилізувати посуд для досліду:
Таблиця 16
Середовища для виділення і культивування протопластів картоплі і тютюну та регенерації з них рослин (мг/л)
Компоненти | W-5 | K-3 | W-S-S* | ST-1 | ST-2 | ST-3 | RMOP |
NaCl | |||||||
NH4NO3 | |||||||
KNO3 | |||||||
CaCl2×2H2O | |||||||
MgSO4×7H2O | |||||||
KH2PO4 | |||||||
KCl | |||||||
Na2PO4×H2O | |||||||
(NH4)2SO4 | |||||||
NH4Cl | |||||||
Fe-хелат | |||||||
H3BO3 | |||||||
ZnSO4×7H2O | 8.6 | ||||||
CuSO4×5H2O | 0.025 | 0.025 | 0.025 | 0.025 | 0.025 | 0.025 | |
CoCl2×6H2O | 0.025 | 0.025 | 0.025 | 0.025 | 0.025 | 0.025 | |
KI | 0.75 | 0.83 | 0.83 | 0.83 | 0.83 | 0.83 | |
Na2MoO4×2H2O | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | |
MnSO4×H2O | |||||||
MnSO4×4H2O | 22.3 | 22.3 | 22.3 | 22.3 | |||
Мезоінозит | |||||||
Гліцин | |||||||
PP | |||||||
Фолієва кислота | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||||
Біотин | 0.05 | 0.05 | 0.05 | ||||
Аденін сульфат | |||||||
Гідролізат казеїну | |||||||
В1 | 0.5 | 0.5 | |||||
В6 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||||
ІОК | 0.1 | 0.1 | |||||
НОК | 0.2 | ||||||
2,4-Д | 0.2 | ||||||
БАП | 0.2 | 0.5 | 0.5 | ||||
Зеатин | 0.5 | ||||||
Сахароза | |||||||
Глюкоза | |||||||
Ксилоза | |||||||
Манітол | |||||||
Агар | 1% | 1% | 0.7% | 0.7% | |||
pH | 5,7 |
* - середовище стерилізувати фільтруванням
- у сушильній шафі: чашки Петрі діаметром 60 мм і 100 мм, колби Ерленмейера на 50 мл закриті фольгою, пастерівські піпетки,
- у автоклаві: колбочки зі скляними лійками з нейлоновими фільтрами, центрифужні пробірки з гумовими пробками, шприц з насадкою для фільтрування, фільтр Зейтца.
Етап 2. Приготування ферментних розчинів
і ферментація тканин.
1. Приготувати ферментну суміш, яка містить 1% Cellulysin, 0,5% Macerase і 0,1% Driselase в середовищі виділення.
Для ферментації мезофілу тютюну використовують суміш, яка містить 0,5% Cellulase, 0,5% Macerase і 0,2% Driselase.
Калюсну тканину картоплі і тютюну ферментують у суміші, яка містить 1-2% Cellulase, 0,5-1% Macerase, 0,5-1% Driselase. Для ферментації варто брати свіжий і м’який калюс, який розсипається у ферментній суміші.
2. Відцентрифугувати суміш 10-15 хв при 2 тис. об/хв для осадження нерозчинних частинок.
3. Довести 1N КОН рН ферментної суміші до 5,6.
4. У боксі за допомогою шприца з насадкою з фільтром “Millipore” профільтрувати суміш у стерильну колбу Ерленмейера.
5. Розлити стерильний ферментний розчин по 7-10 мл в колби Ерленмейера на 50 мл.
Ферментні розчини краще готувати безпосередньо перед дослідом або за добу до досліду.
6. У боксі дістати із пробірки 4-тижневі рослини картоплі і помістити їх у стерильні чашки Петрі.
7. Притримуючи рослини пінцетом, скальпелем обрізати листки.
8. Акуратно притримуючи листки пінцетом, щоб не пошкодити мезофіл, лезом, закріпленим у держаку, нарізати їх тонкими (до 1 мм завширшки) смужками.
9. Листкові смужки помістити на поверхню ферментної суміші у колби Ерленмейера, щоб тканина покривала всю поверхню суміші (» 1 г тканини на 10 мл ферментної суміші).
10. Колби з рослинним матеріалом помістити у термостат на 16 год при температурі 260С.
Оптимальну температуру і час інкубації необхідно підбирати для кожного конкретного випадку.
Етап 3. Виділення та очищення ізольованих протопластів.
1. Після інкубації додати у колби з рослинним матеріалом такий же об’єм середовища виділення.
2. Тотальний препарат протопластів профільтрувати через нейлонову сітку, щоб позбутися немацерованих шматочків тканини і елементів провідної системи.
3. Фільтрат стерильною піпеткою перенести у центрифужні пробірки (» 4/5 об’єму пробірки).
4. На фільтрат по стінці пробірки акуратно за допомогою піпетки нашарувати середовище W-5 (» 1/5 об’єму). Закрити пробірки і відцентрифугувати при 100 g 3 хв.
5. Поки йде центрифугування, у чисті центрифужні пробірки налити середовище W-5 (» 4/5 об’єму).
6. З центрифугату акуратно відібрати стерильною піпеткою верхній шар, в якому містяться протопласти, які флотували на межі середовищ, і перенести у центрифужні пробірки з середовищем W-5 і відцентрифугувати при 80 g 3 хв.
7. Піпеткою акуратно відібрати надосадову рідину.
8. Відмивання протопластів проводимо ще раз.
Етап 4. Культивування ізольованих протопластів
і регенерація рослин.
1. У стерильні чашки Петрі (діаметр 60 мм) налити 2-3 мл середовища для культивування ізольованих протопластів W-S-S.
2. 2-3 краплі густої суспензії протопластів у середовищі W-5 піпеткою перенести в чашки Петрі з середовищем W-S-S.
3. Культивувати протопласти на розсіяному світлі при температурі 250 + 10С. Щодоби спостерігати за розвитком протопластів під інвертованим мікроскопом.
4. Після утворення клітинних колоній (через 8-10 діб) до суспензії клітин додати свіже живильне середовище W-S-S і в міру розведення суспензії частину колоній з середовищем перенести в нові чашки Петрі.
5. Колонії, які досягли розмірів 0,5-1 мм перенести на агарове середовище ST-1 для формування мікрокалюсів. Культивувати на світлі 3-4 клк при 16-годинному фотоперіоді.
6. Через 10-15 днів яскраво-зелені колонії діаметром 1-3 мм перенести на середовище ST-2 для органогенезу і культивувати при 250С, 16-годинному фотоперіоді і освітленні 3-4 клк 25-30 днів. Часто для регенерації рослин необхідно повторно пересаджувати колонії на свіже середовище ST-2.
7. Сформовані пагони висотою 3-10 мм відділити від калюсу і перенести на безгормональне середовище ST-3 для вкорінення.
Оформлення роботи: замалювати ізольовані протопласти і клітинні колонії, описати калюси і рослини-регенеранти.