Ботулинические токсины и вещество хr

Экзотоксины ботулинических бактерий Clostridium botulinum различных штаммов представляют собой смесь двух биополимеров — нейротропного α-токсина, являющегося полипептидом, и гемаглютинирующего β-токсина (гликопротеида). Собственно ботулиническими токсинами, или ботулотоксинами, называют только нейтропные компоненты.

Известно семь типов ботулотоксинов (А, В, С, D, Е, F, G), входящих в состав экзотоксинов ботулинических бактерий разных штаммов, зафиксированных в тех или иных географических регионах планеты. Ботулотоксины всех типов подобны друг другу по характеру поражающего действия, хотя различаются первичными структурами (набором и количеством аминокислот, последовательностью их сцепления), степенью токсичности и иммуногенными свойствами: антитоксин ботулотоксина каждого типа не нейтрализует токсины других типов. Для человека наиболее опасны ботулотоксины ти­пов А, В, Е, F, из которых максимальной токсичностью характеризуется ботулинический токсин типа А. Именно он подробно изучен в военных центрах США, Великобритании и Канады.

Продуцентом ботулотоксина А является бактерия наиболее часто встречающегося соответствующего штамма, имеющая вид жгутиконосной палочки, малоподвижной и питательной среде. Физиологический характер бактерии таков, что она культивируется только при отсутствии воздуха на белковой питательной среде, которая может быть и недоброкачественной. Бактерия впервые была открыта на плохо прокопченной колбасе, откуда и получила свое название (лет. botulus — колбаса). В неблагоприятных условиях кислородсодержащей атмосферы бактерия трансформируется в спору, по внешнему виду напоминающую теннисную ракетку.

Споры бактерий типа А выдерживают солнечный свет, глубокое охлаждение до температуры минус 253 °С и сохраняют жизнеспособность после 6—8-летней вы­держки в пресной и двухмесячной в соленой воде. Они способны к воспроизводству после высушивания в течение 347 дней и более чем столетнего пребывания в почве. Жизнеспособные споры ботулотоксина можно встретить в овощах и фруктах, в личинках мух и дождевых червях, в тканях рыб, птиц и многих животных, в кишечнике человека и животных. Уничтожение спор может быть достигнуто путем кипячения в воде (в течение 6 ч при температуре 100 °С или 20 мин при температуре 120°С), не менее чем 24-часовой обработкой 20% формалином или нагреванием в течение 1 ч в 10% соляной кислоте.

В благоприятных условиях споры за 30—40 мин прорастают в вегетативную бактериальную форму, способную к размножению. Размножение бактерий возможно только в анаэробных условиях. В качестве питательной среды могут использоваться любые белковые продукты: недостаточно просоленное мясо, неправильно обра­ботанные мясные, рыбные, бобовые или грибные консервы, преимущественно домашнего приготовления. В связи с этим даже в высокоразвитых в техническом от­ношении странах нередки случаи бытовых отравлений ботулиническим токсином («ботулизмы») с высоким уровнем смертности. По данным на 1965 год из числа получивших ботулинические отравления умерли в Великобритании 76,5% в США 65%, Дании 40,6%, в Японии 31,9%, в СССР — 24,5% людей.

Для искусственного получения ботулинических экзотоксинов бактерии соответствующего штамма культивируют без доступа воздуха при температуре 30—38 ºС на стерилизованной питательной среде, представляющей собой водную суспензию пшеничной или кукурузной муки в 1—5% соляной кислоте с добавкой нужных микроэлементов. Размножение бактерий, сопровождающееся выделением в воду токсина, осуществляется столь интенсивно, что через несколько дней (7 сут в случае бактерий штамма А или 5 сут в случае бактерий штамма Е) активность среды достигает 2—3 млн шиных единиц 1 в 1 мл.

После разделения фаз на бактериальном фильтре, не пропускающем микробные клетки, токсин осаждают из фильтрата 20% раствором поваренной соли или 0,4% гелем полифосфата натрия и отделяют на центрифуге.

Очистку экзотоксина-сырца осуществляют путем экстракции буферным раствором (рН = 6,5) с последующим осаждением этанолом при температуре 10— 12°С, либо гель-фильтрацией на сефадексах. Нейротропный α-токсин отделяется от аммаглютинирующего β-токсина при рН = 7,5 и более. Многократным повторением операций по очистке может быть достигнуто получение аморфного или кристаллического ботулотоксина любого типа требуемой степени чистоты. Токсичность нейротропных ботулинических токсинов приведена в табл. 9.1.

Таблица 9.1

Токсичность нейротропных ботулинических токсинов

Кристаллический нейротропный α-токсин типа А, выделенный в виде бесцветных игл, представляет собой двудоменную глобулу с молекулярной массой около 150 тыс., в состав которой включены до 1500 аминокислотных остатков. Домены А (молекулярная масса около 51 тыс.) и В (молекулярная масса примерно 99 тыс.), являющиеся линейными полипептидами, связаны друг с другом одним дисульфидным мостиком.

Поражающее действие токсина связано с нарушением нервно-мышечной передачи и является результатом блокады выделения ацетилхолина из синаптических пузырьков в синапсах периферической и центральной нервной системы. Домен В при этом отвечает за транспортирование ботулотоксина в организме, рецепцию на пресинаптической мембране нейрона и структурную перестройку околорецепторного участка этой мембраны с формированием в ней трансмембранного канала. Домен А, освободившийся в результате вссстановления дисульфидной связи, проникает по этому каналу в цитоплазму нервной клетки и препятствует выделению медиатора. Это ведет к прерыванию межнейронной передачи нервных импульсов. Такого рода блокада нервно-мышечной передачи проявляется в паралитических эффектах.

Пищевое отравление ботулотоксином всегда связано с наличием периода скрытого действия, продолжительность которого зависит от принятой дозы и составляет от нескольких часов при поражении самим токсином до 2—3 сут при употреблении в пищу зараженных им продуктов.

Признаки поражения появляются внезапно и начинаются с ощущения слабости, общей подавленности, тошноты, а затем и частой повторной рвоты. Через 3 — 4 ч после начала развития симптоматики наблюдается головокружение, зрачки глаз расширяются и перестают реагировать на внешние раздражители. Зрение становится неотчетливым: пораженный видит все окружающее как бы в тумане; часто развивается двоение в гла­зах.

Последующие симптомы связаны с прекращением функций слюнных и потовых желез. Кожа становится сухой, ощущаются сухость во рту и жажда, сильные боли в желудке. Возникают затруднения в глотании пищи и даже воды: наступает паралич глотательной мускулатуры. Речь пораженного становится невнятной, голос очень слабым. Иногда могут наблюдаться расстройство дыхания и судороги.

Аналогичная симптоматика характерна при попадании аэрозолей ботулинических токсинов через органы дыхания и через желудочно-кишечный тракт, а также при введении экзотоксинов в кровяное русло. В случае летальных доз смерть наступает спустя несколько суток в результате паралича дыхательной мускулатуры в сердечной мышцы. При нескольких летальных дозах токсина симптоматика «смазана» во времени и смерть может наступить спустя двое-трое суток, а при 100— 1000 летальных дозах — в течение нескольких часов. При нелетальных дозах полное выздоровление наступает нескоро: местные параличи мышц, иннервируемых лицевыми нервами, и двоение в глазах длятся месяцами.

В табл. 9. 1 приведена средняя смертельная доза для мышей кристаллического ботулотоксина типа А. Смесь α-токсина с сопутствующим ему гемаглютинирующим β-токсином (аморфная форма) характеризуется несколько меньшей токсичностью. Так, для природного ботулинического экзотоксина типа А токсодоза LD₅₀ 1,5·10^-6 мг/кг (мыши, внутрибрюшинно).

Высокая токсичность и доступность ботулинических экзотоксинов обусловили рассмотрение их в США, Великобритании и Канаде в 60—70-х годах в качестве химических агентов смертельного действия. В результате многолетних исследований к 1975 г. аморфный ботулотоксин типа А был принят на вооружение армии США под шифром XR. Запасы токсина хранятся в арсенале Пайн-Блафф (штат Арканзас).

Боевое назначение XR — уничтожение живой силы противника. Достижение этой цели предусматривается прежде всего аэрогенным заражением приземного слоя атмосферы порошкообразным XR из генераторов аэрозолей или гелеобразным токсинными рецептурами из дисперсионных боевых приборов авиации. Относительна токсичность при ингаляции для человека LCτ₅₀ 0,00002 мг·мин/л для сухого XR, 0,0001 мг·мин/л — для его рецептур. Период скрытого действия составляет несколько часов, летальный исход может наступить в течение 1—3 сут. Аэрозоль не теряет поражающих свойств в воздухе до 12 ч. Токсин может быть использован также в средствах микстовых поражений. Подкожные токсодозы для человека ориентировочно LD₅₀ 2·10^-6 - 4·10^-5 мг/кг. Период скрытого действия и сроки летального исхода короче, чем при ингаляции, и составляют от нескольких десятков минут до нескольких часов. Нельзя исключать возможность диверсионного заражения XR питьевой воды и продуктов питания. Для человека пероральная токсодоза LD₅₀ 5,7·10^-5 мг/кг. Такиь образом, XR — наиболее токсичное из всех известных на сегодняшний день смертоносных веществ природного и синтетического происхождения.

По внешнему виду XR представляет собой мелкий порошок серого цвета без вкуса и запаха. Гигроскопичен и образует в воде, водных растворах солей и кислот (рН = 2—7) стабильные лиофильные гели с концентрацией XR 1—2,5 г/л. В сухом виде устойчив на солнечном свету при температуре от минус 30 до плюс 50 °С и инертен к гнилостным бактериям. В темноте при низкой температуре и в бескислородной атмосфере может сохраняться в течение нескольких лет. Возможно хранение XR в виде токсинных рецептур — кислых лиофильных гелей с добавкой консервантов (белков и полисахаридов). Сроки хранения рецептур в темноте при температуре 0—4 °С — до 13 лет.

Химические свойства XR аналогичны для всех токсинов. Он имеет удовлетворительную термическую устойчивость, выдерживает 90-часовое прямое солнечное облучение, относительно инертен к кислым и нейтральным водным средам. Так, в холодной непроточной воде XR сохраняется в течение недели. Гидролиз с образованием нетоксичных полипептидных фрагментов завершается при температуре 80 °С течение 1 ч, при температуре 100 °С — за 10—15 мин. Скорость гидролиза несколько взрастает в щелочных средах.

Дезактивация XR может быть достигнута водными растворами веществ окислительно-хлорирующего действия с содержанием активного хлора 100—350 мг/л, например 0,1—0,2% растворами хлораминов или гипохлоритов. Особенно легко дезактивируют XR растворы формальдегида: после обработки зараженных поверхностей 10—40% формалином токсичность снижается на 99% в течение одной минуты.

Способность XR флюоресцировать в ультрафиолетовой области спектра позволяет осуществлять инструментальную неспецифическую индикацию токсина, идентификация XR затруднена, поскольку внешние признаки его применения могут отсутствовать, а специфическая индикация возможна только с использованием методов иммунобиологии, требующих значительного времени.

Защита от аэрозоля XR надежно обеспечивается противогазами и респираторами. Лечение пораженных основало на симптоматическом принципе: на любой стадии используются антитоксины совместно с антибиотиками, а на поздних стадиях — дополнительно вводятся сосудорасширяющие средства и стимуляторы сердечной деятельности и дыхательного центра. Такими способами может быть обеспечено снижение смертности с 90% до 15—30%. Относительно невысокая надежность терапевтического эффекта антитоксинов и антибиотиков объясняется заведомой несвоевременностью их применения в связи с наличием периода скрытого действия XR: поражение развивается значительно раньше, чем проявляются его признаки.

Наиболее эффективным методом медицинской защиты является профилактическая иммунизация вакцинами анатоксина. Однако при этом следует иметь в виду, что 10—30% людей неспособны к иммунизации, а возникновение искусственного иммунитета к XR у остальных людей достигается лишь в течение четырех недель и более. К тому же в дозах XR 103—104 LD₅₀ даже появившийся искусственный иммунитет может быть преодолен.