Вопрос 3. Определение белков

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ.

Присутствие белков можно определить по: цветных реакциях (биуретовая – на пептидные связи и нингидриновая – на альфааминокислоты)и специфическими (ксантопротеиновая – на ароматические а.к., Паули – гистидин и тирозин, Адамкевича и Вуазене – триптофан, нитропруссидная – цистеин, Сакагучи – аргинин). По результатам можно судить о ценности белка. Реакции осаждения: солью, органическими растворителями, концентрированными кислотами, щелочами, ионами тяжелых металлов, температурой и изоэлектрическим фокусированием При добавлении веществ перечисленных гидратная оболочка белка разрушается и они выпадают в осадок. Но при этом происходит денатурация, потеря активности, которую можно смягчить проводя исследования при 4С.

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ: Схема: 1. Измельчение материала (гомогенизация), 2. экстрагирование (выделение и очистка).

1. Разрушение клеточной структуры тщательное в гомогенизаторах, мельницах, попеременным замораживанием-оттаиванием, ультразвуком, протирание через пресс, насыщение азотом под давлением, которое сбрасывается и клетки разрушаются. Способ подбирают в зависимости от биологического материала. Животные ткани (печень, мозг) гомогенизируются легко, а при наличие сосудистой, соединительной ткани, клеточных прочных стенок измельчают путем растирания с твердыми материалами (песок, абразивный порошок), обрабатывают ферментными препаратами (целлюлазой, хитиназой), лизоцимом. Вся работа в холодной комнате или на льду.

2. Экстракция может совмещаться и с гомогенизацией, если продукт зарание измельчен. Для определения активности ферментов белка достаточно одноразовой экстракции, для количественного определения белковых фракций зерна – трех – пятикратной экстракции. Большинство животных белков растворимы в 5-10% растворах солей, для зерновых нужен более широкий набор растворителей (цитратные, боратные, фосфатные буфера, трис НCL), органические растворители, неионные детергенты, разрывающие белок-липидные и белок-белковые связи. Растворители подбирают с учетом разрыва определенных связей. Уксусная – ионные, мочевина – водородные и гидрофобные, салицилат натрия и ДДС натрия – гидрофобные и ионные, спирты – водородные и гидрофобные.