Методы очистки

А) от небелковых соединений и др белков: фракционирование высаливанием сульфатом аммония, где роль играет валентность. Глобулины выпадают в осадок при 50% осаждении, альбумины – при 100%, а при ступенчатом высаливании (фракционировании)20-100% выпадают белки других классов. Б) Адсорбционная хроматография на различиях полярности белков. На колонке упакован адсорбент с буфером, нанесен образец. Компоненты смеси адсорбируются, затем вымываются буфером с увеличивающейся концентрацией или полярностью.

В) Распределительная хроматография. Неподвижная фаза – вода, удерживаемая твердой фазой (силикагель, бумага). Разделяемые в-ва распределяются между водным слоем и движущейся фазой растворителя и с разной скорость перемещаются по колонке или бумаге. Используют для анализа а.к. и пептидов. Адсорбент – нити целлюлозы, растворитель – смесь органических растворителей (спирт-уксусная кислота-вода). Хроматограмму высушивают и ангализируют местонахождение разделяемых компонентов.

Г) ионообменная хроматогарфия – на основе общего заряда молекул. Если белок в нейтральной среде имеет положительный заряд, то связывается на колонке с ионообменником, содержащем фенольные, сульфо- и карбоксильные группы (катионообменник), если отрицательные – с аминами и органическими основаниями (анионообменник). Для фракционирования используют производные полистирола и целлюлозы. Положительнозаряженный белок снимается с колонки с помощью раствора хлорида натрия, белки с меньшим зарядом вымываются первыми.

Д). Хроматография по сродству (аффинная) основана на принципе избирательного связывания белков со специфическими веществами (лигандами), прикрепленными к носителю. Лиганд (глюкозу) ковалентно присоединяют к носителю (иммобилизация) и наносят на колонку белок. Несвязавшиеся белки удаляют буфером, а нужные элюируют раствором, содержащим лиганд в высокой концентрации. При этом присоединенные к колонке остатки глюкозы в молекуле белка замещаются на глюкозу раствора.

Е) Гель-фильтрация (метод молекулярных сит) – пропускание белков через колонку с сефадексом, агарозой, пористый кварц. Зерна разных номеров содержат поры разных размеров, в которые проникают белки определенной молекулярной массы. Низкомолекулярные как внутри, так и снаружи частиц полимера, высоко только между. Поэтому проходят через колонку и первыми вытекают только высокомолекулярные белки и собираются отдельными фракциями.

Ж). Электрофоретические методы – разделение на способности молекул пептидов иаминокислот, находясь в заряженной форме в виде катионов + или анионов _, передвигаться в электрическом поле с определенной скоростью. Кроме того, молекулы с близкими зарядами, но разными массами отличаются отношением заряда к массе и передвигаются с разной скоростью. Скорость миграции зависит от напряжения электрического поля, заряда белков, сопротивления трения. Метод имеет модификации – нативный, денатурирующий, диск-электрофорез (р-ры с разными рН и ДДС-Nа, гели разной пористости. Для обнаружения белков используют окрашивание амидовым черным, кумаси синим R-250. Интенсивность определяют сканированием на денситометре. Двумерный электрофорез – смесь разделяют на столбиках геля электрофорезом в горизонтальном направлении, затем в гелевых пластинах в вертикальном..

З) Изоэлектрическое фокусирование в основе фронтальный электрофорез, проводимый в градиенте рН и напряжении. На колонку с носителем подают раствор сильной кислоты, снизу щелочной для установления градиента рН с крайними значениями. Разделение по изоэлектрическим точкам.

И) Иммуноэлектрофорез, метод пептидных карт (пептиды получают гидролизом, на бумаге разделяют в горизонтальном направлении электрофорезом, в вертикальном распределительной хроматографией, пептиды окрашивают нингидрином и определяют состав), ультрацентрифугирование (в градиенте плотности на разных уровнях центрифужной пробирки в процессе седиментации в виде зон разделение идет). Используют для определения молекулярных масс.

Гомогенность белка определяется на последнем этапе выделения и очистки методом электрофореза.

Содержание белка в пищевых объектах обычно определяют по количеству азота с использованием метода Кьельдаля. С целью упрощения и сокращения длительности анализа этот метод с момента его разработки модифицировался. Созданы автоматические анализаторы, стоимость определения содержания белка на которых и сегодня остается высокой. Для перевода к-ва азота в содержание белка используют коэффициент 6,25, т.к. большинство белков содержат 16% азота (100/6,25=16). Однако более правильным является использование коэффициентов, соответствующих фактическому содержанию сырого белка в каждом его виде. Есть метод определения азота Дюма (разложение органического соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим замером азота. Содержание белка рассчитывают по количеству гамма-лучей. Метод инфракрасной спектроскопии (поглощения белками определенных длин волн), методы на различной степени помутнения, способности адсорбировать красители, преломлять лучи света (Кумаси, Лоури, биуретовый). По оптической плотности и калибровке находят концентрацию.