Антинуклеарный фактор и антинуклеарные антитела

Лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний

журнал "Terra Medica nova" № 3 (15) 2007

С. В. Лапин, кандидат медицинских наук
А. А. Тотолян, доктор медицинских наук
Научно-методический центр по молекулярной медицине;
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова

Залогом эффективного лечения многих аутоиммунных заболеваний и предотвращения инвалидизации больного является тщательное лабораторное обследование. Его основу составляет выявление аутоантител в сыворотке крови и биологических жидкостях. В обзоре представлены принципиальные подходы к использованию аутоантител в качестве диагностических маркеров, описаны основные семейства аутоантител и применение конкретных серологических тестов в диагностике широкого спектра аутоиммунных заболеваний.

Заболевания, в патогенезе которых лежит патологическая реакция иммунной системы против собственных антигенов организма, относят к аутоиммунным. Врачам практически всех специальностей приходится сталкиваться с аутоиммунными процессами. Аутоиммунные состояния преобладают в ревматологии, нефрологии, дерматологии, часто отмечаются в гастроэнтерологии, неврологии, пульмонологии и многих других терапевтических специальностях (табл. 1). Распространенные аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, инсулинзависимый сахарный диабет, системные заболевания соединительной ткани, ускоряют течение атеросклероза и приводят к сердечно-сосудистой патологии. В основе атеросклероза, как полагают многие исследователи, лежит аутоиммунная реакция в отношении компонентов соединительной ткани сосудистой стенки и компонентов плазмы крови.

Таблица 1. Частота основных аутоиммунных заболеваний в США (данные за 1996 г.)

Механизмы нарушения иммунологической толерантности при аутоиммунных заболеваниях изучены плохо. Очевидно, что важную роль играет генетическая предрасположенность, обусловленная набором генов системы HLA, которые определяют направление иммунного ответа. На фоне предрасположенности определенное сочетание факторов внешней среды, включающее тканевое воспаление, вирусные и бактериальные инфекции, разрушение ткани или нарушение функций гематотканевых барьеров, приводит к сенсибилизации по отношению к собственным антигенам.

Хотя клеточный иммунный ответ лежит в основе аутоиммунных заболеваний, однако до сих пор не существует надежных и стандартизованных методов определения клеточных реакций против собственных антигенов. В то же время гуморальные иммунные ответы, характеризующиеся появлением аутоантител, широко используются в диагностике аутоиммунных заболеваний.

Аутоантитела представляют собой иммуноглобулины классов IgG, IgA, IgM, специфически связывающиеся с антигенными эпитопами молекул человеческого организма, хотя в лабораторных методах иногда используются близкие или идентичные человеческим антигены лабораторных животных. Известно, что аутоантитела, реагирующие с человеческими антигенами, изредка могут отмечаться на фоне нормального функционирования иммунной системы. Характерно, что в норме или на фоне неиммунных заболеваний аутоантитела выявляются в низких титрах, т. е. обладают низкой аффинностью. Среди аутоантител, которые чаще других отмечаются в норме, выделяют антинуклеарные антитела, небольшое содержание которых может быть выявлено у 2–3% здоровых лиц, несколько чаще — у пожилых, а также ревматоидный фактор, встречаемость которого в пожилом возрасте может достигать 10% популяции. Сравнительно часто на фоне неиммунных заболеваний выявляются антикардиолипиновые антитела, антитела к тиреопероксидазе и тиреоглобулину. Причина появления аутоантител на фоне нормального функционирования иммунной системы неизвестна, однако, как полагают, аутоантитела в норме могут играть определенную роль в осуществлении аутотолерантности и предотвращении развития аутоиммунных процессов.

Роль аутоантител в патогенезе большинства аутоиммунных процессов четко не определена. При подавляющем большинстве аутоиммунных заболеваний аутоантитела не принимают участия в конкретных патогенетических механизмах и являются свидетелями аутоиммунного процесса. Действительно, практически при каждом аутоиммунном заболевании может быть определена группа так называемых серонегативных форм, при которых аутоантитела не обнаруживаются даже при классическом течении заболевания. Прежде всего, это связано с несовершенством применяемых лабораторных методов, и по мере описания новых разновидностей аутоантител группа «серонегативных» пациентов сужается. В то же время этот факт подчеркивает разнообразие мишеней аутоантител и широкую направленность иммунного ответа.

Антинуклеарный фактор и антинуклеарные антитела

Антинуклеарные антитела (АНА) представляют собой семейство аутоантител, насчитывающее около 200 разновидностей, которые способны связываться с нуклеиновыми кислотами и ассоциированными с ними белками. Они встречаются более чем у 90% пациентов с диффузными заболеваниями соединительной ткани, такими как системная красная волчанка, склеродермия, смешанное заболевание соединительной ткани, синдром Шегрена, аутоиммунные заболевания печени. Представители этого семейства аутоантител могут быть обнаружены при множестве инфекционных, воспалительных и онкологических заболеваний. Все это обусловливает большое клиническое значение серологического обследования больных с подозрением на системное аутоиммунное заболевание. Действительно, тесты по определению АНА являются наиболее часто выполняемыми лабораторными анализами во всех клинических иммунологических лабораториях.

Общепризнанный стандарт определения АНА — выявление антинуклеарного фактора (АНФ) на перевиваемой клеточной линии НЕр- 2 с помощью непрямой иммунофлуоресценции. Совместно с НЕр- 2 клетками может использоваться печень приматов, применение которой улучшает выявление некоторых разновидностей АНА. Этот подход широко используется в наборах для непрямой иммунофлуоресценции, предлагаемых немецкой фирмой «EUROIMMUN». Подобный подход позволяет лучше дифференцировать ряд антинуклеарных антигенов, включая SSA, RNP, Ku. Другим надежным субстратом является модифицированная линия клеток НЕр-2 — клетки Hep -20–10, обладающая высоким митотическим потенциалом и увеличивающая выявляемость антител к антигенам митотических клеток, таких как PCNA и центромеры. Некоторые фирмы («Immunoconcepts», США) предлагают также клетки Hep -2000, которые содержат дополнительный ген SSA антигена и обладают повышенной чувствительностью для его выявления.

Результат метода выражается в титре, который указывает на содержание и аффинность аутоантител. Норма составляет менее 1/80, причем низкие титры АНФ 1/80–1/160 изредка могут отмечаться у клинически здоровых лиц. Обнаружение высоких титров АНФ более 1/320 с большей вероятностью указывает на системное ревматическое заболевание. Кроме определения титра, АНФ на перевиваемой клеточной линии НEр -2 позволяет описать тип свечения ядра клетки, который указывает, с какими антигенными мишенями взаимодействуют аутоантитела. Определяются 6 основных типов свечения и около 20 минорных типов свечения, описание которых самостоятельного диагностического значения не имеет. Гомогенный и периферический типы свечения ядра наиболее характерны для системной красной волчанки; гранулярный отмечается при синдроме Шегрена, смешанном заболевании соединительной ткани и артритах; ядрышковый и центромерный типы свечения характерны для склеродермии и ее разновидностей. Цитоплазматический тип свечения клетки отмечается при аутоиммунных заболеваниях печени.

К сожалению, в связи с методическими ограничениями, в большинстве отечественных лабораторий популярность получили скрининговые иммуноферментные тесты для определения антинуклеарных антител (антител к экстрагируемым ядерным антигенам), основанные на методе ИФА. Их иногда приравнивают к определению АНФ, хотя мы считаем целесообразным называть термином «АНФ» только иммунофлуоресцентный тест выявления АНА. Иммуноферментные тесты определяют АНА, направленные только к растворимым антигенам ядра клетки. По нашему опыту, они могут упускать до трети положительных результатов выявления АНА, и в то же время эти методы являются сравнительно неспецифичными.

После обнаружения АНФ или антител к экстрагируемым ядерным антигенам необходимо установить клеточную мишень АНА, так как определение спектра АНА тесно связано с конкретным диагнозом. Минимальный набор обычно включает определение антител к Sm, RNP, SS-A и SS-B антигенам, а также Scl -70, CENT-B и Jo -1. Такой спектр обобщает наиболее часто встречающиеся мишени АНА, а также основные ревматические заболевания.

Одним из наилучших подходов к определению спектра АНА является использование метода иммуноблота, который представляет собой надежную (и более дешевую) альтернативу ИФА. Так, в лайн-блоте «АНА-профиль 3», основанном на очищенных и рекомбинантных антигенах, производимом фирмой «EUROIMMUN», в одном тесте выявляются антитела к 15 различным внутриклеточным антигенам, охватывающим большинство ядерных мишеней АНА.