Препараты на основе рекомбинантных белков и пептидов

Особенностью биотехнологии, в том числе связанной с медициной, является то, что в ее основе лежит большое количество новых современных дисциплин, таких как: биология, молекулярная биология, биохимия, генетика, клеточная инженерия, генетическая инженерия и многие другие. Это позволяет современной молекулярной биотехнологии получать новые лекарственные препараты, диагностические и профилактические средства, участвовать в лечении некоторых заболеваний. Значительный прогресс был достигнут в этой дисциплине при внедрении достижений генетической инженерии, с помощью которой удалось добиться ранее невозможного, а именно: заставить биообъекты синтезировать новые, ранее не присущие им биологически активные вещества (БАВ).

Генная инженерия — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого организма.

Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого или генетически модифицированного организма. В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования.

Красная биотехнология (red biotechnology) [греч. bios — жизнь, techne — искусство, мастерство и logos — учение] — использование биотехнологических процессов и методов в медицине, напр. в создании биофармацевтических препаратов (белков, ферментов, антител), а также в генной и клеточной терапии. Термин «К.б.» предложен в 2003 г. на Всемирном форуме по биологическим наукам.

Биообъекты, в которые путем генно-инженерных манипуляций введена чужеродная ДНК, ответственная за синтез чужеродного или гетерологичного продукта, носят название рекомбинантных. Синтезируемые этими биообъектами чужеродные вещества также называют рекомбинантными. Если речь идет о белках или пептидах, то их называют рекомбинантными белками и пептидами.

Белковая инженерия (protein engineering) [франц. ingenier — инженер, от лат. ingenium — способность, изобретательность] — совокупность генно-инженерных и биохимических методов, с помощью которых создают рекомбинантные белки (см. Рекомбинантный белок) и осуществляют модификацию физико-химических или биологических свойств природных белков с целью улучшения их качества (см. Белок). Замены отдельных аминокислот или комбинирование крупных блоков полипептидных цепей (доменов) разных белков используются в биотехнологии для создания белков с новыми свойствами. Примером методов, используемых в Б.и., является мутагенез in vitro, позволяющий изменять кодирующую способность гена в определенном месте (напр., в пределах области, кодирующей активный центр белка).

В современной медицине с помощью подобных подходов получают следующие лекарственные средства: полипептидные гормоны (инсулин, соматотропин), интерфероны, цитокины (фактор роста эпидермиса, инсулиноподобные факторы роста, тромбоцитарный фактор роста, фактор роста фибробластов), вакцины (поверхностный антиген вируса гепатита В, белок малярийного плазмодия, белок оболочки HIV-1), и другие БАВ (α₁-антитрипсин, фактор XIIIа системы свертывания крови, ферменты).

В настоящее время на базе любых микро-биообъектов можно получать, и получают рекомбинантные производные. Однако обычно самым распространенным является получение рекомбинантных микроорганизмов. К микроорганизмам, которые для этих целей используются чаще всего, относятся: Escherichia coli, Bacillus spp., Erwinia spp., Pseudomonas spp., Rhizobium spp., Saccharomyces cerevisiae и другие.

Для того, чтобы микроорганизмы можно было использовать в качестве генетически модифицированных продуцентов лекарственных средств, они должны удовлетворять некоторым обязательным требованиям.

1.Микроорганизм-реципиент не должен обладать патогенностью и токсигенностью.

2.Безопасность генно-инжененрных производных.

3.Быстро размножающиеся штаммы.

4.Желателен рост на простых питательных средах.

5.Возможность образования суспензий высокой плотности.

Для внесения чужеродной ДНК в микроорганизмы необходимы специальные носители. В качестве таких носителей можно использовать: 1)плазмиды;

2)различные типы бактериофагов (в первую очередь это бактериофаги l и М13);

3)космиды;

4)фагмиды, фазмиды;

5)многообразие сверхъемких векторов (так называемых «искусственно созданных» хромасом (AC – artificial chromosomes)

YAC Yeast Artificial Chromosomes – дрожжевые искуственно созданные хромосомы	BAC Bacterial Artificial Chromosomes – искусственные хромосомы бактерий	PAC-P1 Phaqe-derived Artificial Chromosomes – искусственно полученные мини-хромосомы бактериофагов,
и «сверхдлинные»:
МАС Mammilian Artificial Chromosomes – искусственные хромосомы животных	HAC Human Artificial Chromosomes – искусственно полученные хромосомы человека

Создание последних двух типов АС было инициировано исследованиями генов в хромосомах высших органов: растений, животных, человека, в том числе и полное секвенирование их геномов (длина отдельных исследуемых фрагментов ДНК достигает нескольких сотен тысяч пар оснований, а длина одной из типичныхт хромосом человека составляет 100-200 миллионов пар оснований).

Наиболее распространённым типом носителей необходимой информации – векторами в генной инженерии являются рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие целевые гены и представляющие собой кольцевые, ковалентно замкнутые двухцепочечные молекулы. Цепи ДНК в этих молекулах составляют от 2000 до 200000 тысяч пар нуклеотидов – т.п.н. (или тысяч пар оснований – т.п.о.). Эти внехромосомные генетические элементы встречаются во множестве бактериальных систем. Они способны автономно реплицироваться в них, что сопряжено с участком – origin of replication (ori). Представленные в достаточном количестве копии плазмид (их количество колеблется от одной до десятков и даже сотен) достаточно легко отделить от более значительных по размеру хромосомных и ядерных клеточных ДНК. Они должны нести один или несколько маркерных участков (с помощью маркеров легко выявлять клетки, внутри которых находятся эти векторные молекулы). И наконец, плазмиды должны содержать единичный уникальный сайт. Сайт – это небольшой участок ДНК длиной от 4 до 10 пар нуклеотидов (п.н. или п.о.) – для одного фермента рестрикции (или несколько сайтов для нескольких ферментов-эндонуклеаз рестрикции).

Создание новых плазмидных векторов

1 этап – назовем его рестрикцией – связан с обработкой эндонуклеазой рестрикции какого-то известного источника ДНК – возможно этим объектом будет какая-то уже известная плазмидная конструкция.

Рестриктаза – это эндонуклеаза, узнающая какую-то последовательность внутри цепи ДНК (сайт рестрикции, см. выше) и проводящая гидролиз (разрыв) этой цепи. Сейчас насчитывается 5 классов этих ферментов.

1) Рестриктазы класса 1 разрывают молекулы ДНК в произвольных точках, рестриктазы I и III классов обладают метилирующей и эндонуклеазной активностью.

2) ферменты II класса, которые и используются в генной инженерии, состоят из двух отдельных белков: рестрикционной эндонуклеазы и модифицирующей метилазы.

• В настоящее время используется свыше 400 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы. Название фермента отражает название микроорганизма, из которого его выделяют.

Желательно, чтобы этот объект подвергся гидролизу в одном месте (сайте рестрикции), какой-либо рестриктазой.

Тем же ферментом (это очень важно) «вырезают» нужный ген (или участок ДНК, содержащий этот нужный – целевой ген) из какого-то другого плазмидного вектора. Если этот нужный участок не очень велик, то его можно синтезировать (что конечно, более затратно), оснастив соответствующими «концами» (окончаниями) с обеих сторон).

Так как действовали в обоих случаях одними и теми же ферментами (т.е. ферментами, узнающими и расщепляющими одни и тем же специфические нуклеотидные последовательности (сайты) в двуцепочечной молекуле ДНК, то выполняется важное в молекулярном клонировании обстоятельство о совпадении «концов» принимающей информацию молекулы ДНК и внедряемого фрагмента ДНК.

Гидролиз («расщепление») молекулы ДНК в нужном сайте эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами) «липких» концов или (прямых) «тупых» концов.

II этап – встраивание фрагментов в принимающую ДНК и лигирование. Проводится совместное выдерживание «разрезанной» плазмидной ДНК и участка, содержащего интересующий исследователя ген в течение определенного времени в необходимых термальных условиях. В результате этого становится возможным объединение плазмиды и гена при помощи фермента ДНК-лигазы, который их как бы «сшивает», образуя ковалентные фосфодиэфирные связи. Возникает новая рекомбинантная плазмидная ДНК (новый вектор).

Полученный новый вектор выдерживается в течение определенного времени совместно с микроорганизмами-реципиентами. В целом ряде случаев плазмида-вектор внедряется внутрь клеток. Этот процесс носит название – трансформация. Для отбора трансформированных клеток смесь (протрансформированных и непротрансформированных) микроорганизмов высевают на среду, содержащую соответствующий фактор селективности (например, тот же антибиотик, ген устойчивости к которому был в плазмиде). Выросшие на селективной среде колонии проверют на способность к синтезу нужного биологического объекта.

Процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введения этих элементов в клетки-хозяева называется созданием геномной библиотеки (банка клонов, банка генов).

Все системы клонирования должны отвечать двум основным требованиям:

1) наличию нескольких сайтов для клонирования;

2) возможности достаточно простой идентификации клеток с рекомбинантными ДНК.

Для всех рутинных процедур молекулярного клонирования широко используется E.coli в качестве клетки-хозяина. Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными; компетентность E.coli повышают, используя специальные условия культивирования. Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов E.coli была сконструирована плазмида, содержащая сильный промотор, селективный маркерный ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами для рестрицирующих ферментов – полиленкер.

Эффективными методами трансформации E.coli плазмидами является электропорация (воздействие на клеточные мембраны электрическим током для увеличения их проницаемости). Для введения клонированных генов в соматические клетки также применяют микроинъекции и микроукалывания или слияние с клеткой нагруженных ДНК мембранных везикул (липосом).

По подобной схеме были получены многие продуценты лекарственных средств, перечисленные выше.