Ендонуклеази рестрикції (рестриктази) – це ферменти, що специфічно гідролізують молекули дволанцюгових ДНК при наявності в них певних послідовностей нуклеотидів, які називаються сайтами рестрикції. За механізмом дії та молекулярною структурою розпізнають три типа рестриктаз. В технології рекомбінантний ДНК використовуються рестриктази ІІ-го типу, які впізнають специфічні послідовності нуклеотидів у точці розщеплення ДНК, або в безпосередній близькості від неї. Для прояву активності вони потребують певних умов – наявності в рестрикційній суміші АТР та іонів Mg2+.
Назви рестриктаз складаються з перших літер видових назв бактерій, в яких їх виявили, наприклад Eco – Escherichia coli (це одна з перших ендонуклеаз рестрикції). В деяких випадках позначають штам бактерій, з яких виділили ферменти, наприклад Hinc і Hind –рестриктази з клітин Haemophilus influenzae, штами с і d. Цифри в назві ферментівозначають порядковий номер відкриття відповідних рестриктаз, наприклад Hae I, Hae IІ, Hae IІІ – ферменти із Haemophilus aegipticus (табл.3).
Більшість рестриктаз типу ІІ впізнають на ДНК певні тетра- і гексануклеотидні послідовності, але зустрічаються рестриктази, що впізнають послідовності з п’яти і восьми нуклеотидів (табл.6).
Деякі рестриктази, такі як Hind ІІ, розщеплюють ДНК в середині сайта впізнавання і утворюють сегменти з “тупими кінцями”:
Hind ІІ | |
5′ -GTC↓GAC – 3 3′ -CAG↓CTG - 5′ | |
5′ -GTC 3′ -CAG | GAC - 3′ CTG - 5′ |
Інші ферменти, такі як Eco RI, утворюють розриви, які проходять навскіс таким чином, що на кінці кожного ланцюга дуплекса ДНК лишаються короткі одноланцюгові хвости, відомі як “липкі кінці”:
EcoRI | |
5′ - GAATTC - 3′ 3′ - CTTAAG - 5′ | |
5′ -G 3′ -CTTAA | AATTC - 3′ G - 5′ |
“Липкі кінці” можна з’єднувати між собою та “липкими кінцями” інших ДНК.
Деякі рестриктази, такі як Bam HI, Bcl I, Bgl II, Xho II, впізнають різні сайти рестрикції, але утворюють однакові “липкі кінці” - GATC. Утворення “липких кінців” певної послідовності (NCGA) характерно і для групи рестриктаз Sal I, Xho I, Ava I. При зшиванні за допомогою лігази фрагментів ДНК, утворених рестриктазами однієї з цих груп, відбувається їх об’єднання, але при цьому губляться початкові сайти рестрикції, в результаті чого утворюються нові послідовності нуклеотидів.
Рестриктази, що впізнають одну й ту саму нуклеотидну послідовність називають ізошизомерами. Більшість сайтів рестрикції – поліндроми:
Eco RI 5′ - GAATTC - 3′
3′ - CTTAAG - 5′
Kpn I 5′ - GGTACC - 3′
3′ - CCATGG - 5′
Сайти деяких рестриктаз асиметричні:
Hga I 5′ - GACGC(N5) ↓- 3′
3′ - CTGCG(N5)(N5)↓- 5′
Таким чином утворюються унікальні фрагменти. При конструюванні рекомбінантнх молекул часто використовують штучні сайти рестрикції для кількох рестриктаз одразу – полілінкери – синтезовані хімічним шляхом олігонуклеотиди.
Обробка зразка ДНК певною рестриктазою дає постійний набір фрагментів при умові, що розщеплення відбувається по всім сайтам впізнавання. Якщо задіяти декілька ферментів рестрикції, то можна побудувати рестрикційну карту даної ДНК – послідовність знаходження сайтів рестрикції вздовж молекули. Для цього ДНК обробляють спочатку кожною з рестриктаз, а потім їх сумішшю. Розміри одержаних фрагментів визначаються методом гель-електрофорезу, при цьому спостерігається міграція фрагментів ДНК в тонкому шарі агарозного поліакріламідного геля. Швидкість міграції залежить від довжини фрагмента. Молекули ДНК не денатурують, їх можна виділити у вигляді біологічно активних дволанцюжкових молекул. Гелі обробляються спеціальними барвниками, які зв’язуються з ДНК і утворюють набір чітких смуг. Використання рестрикційних карт дозволило ідентифікувати генетично важливі ділянки ДНК і розробити методи секвенування нуклеїнових кислот.
Таблиця 3
Сайти рестрикцій найбільш відомих рестриктаз при нормальних умовах
Мікроорганізми | Скорочення | Послідовність 5′ - 3′ 3′ - 5′ |
Bacillus amulolique- fasiens H | Bam HI | G↓GATCC CCT↓AG↑G |
Brevibacterium albidum | Bal I | TGGCCA ACC↑GGT |
Escherichia coli RY13 | Eco RI | G↓AATTC CTTAA↑G |
Haemjphilus aegyptius | Hae II | PuGCGC↓Py Py↑CGCGPu |
Haemjphilus aegyptius | Hae III | GG↓CC CC↑GG |
Haemjphilus haemolyticus | Hha I | GCG↓C C↑GCG |
Haemjphilus influenzae Rd | Hind II | GTPy↓PuAC CAPu↑PyTG |
Haemjphilus influenzae Rd | Hind III | A↓AGCTT TTCGA↑A |
Haemjphilus parainfluenzae | Hpa I | GTT↓AAC CAA↑TTG |
Haemjphilus parainfluenzae | Hpa II | C↓CGG GGC↑C |
Providencia stuartii 164 | Pst I | CTGCA↓G G↑ACGTC |
Streptomyces albus G | Sal I | G↓TCGAC CAGCTG |
Xanthomonas oryzae | Xor II | CGATC↓G G↑CTAGC |
Таблиця 4