Некоторые специальные методы приготовления и окрашивания препаратов (методика исследования биоматериала)

4.1. Практические задания. Напишите, как готовятся растворы, методику проведения реакции и результат.

Вариант 6. Окрашивание липидов суданом III.

Является наиболее распространенным методом выявления жира.

Приготовление раствора красителя.

В 100 мл горячего 70% спирта засыпают 0,2—0,3 г порошка судана III, несколько раз взбалтывают и ставят в термостат (при58°С) на несколько часов, затем охлаждают и фильтруют.

Метод.

1. Замороженные срезы (из свежей или фиксированной в формалине ткани) на несколько минут переносят из воды в 50% спирт.

2. Помещают в спиртовой раствор красителя на 15—30 мин (бюксы следует закрывать, так как испарение спирта приводит к выпадению осадков красителя).

3. Быстро ополаскивают в 50% спирте.

4. Промывают в дистиллированной воде.

5. Подкрашивают ядра кислым гемалауном.

6. Промывают и заключают в желатин или глицерин-желатин (обезвоживание в спиртах

экстрагирует жиры).

Результат.

Жировые вещества интенсивно оран­жевого цвета, ядра —"синие. Препараты выцветают сравнительно скоро, поэтому откладывать исследование не рекомендуется.

 

Вариант 11. Методы исследования кожи и ее производных. Окраска азаном.

Окрашивание азаном по методу Гейденгайна – является модификацией метода Маллори, что позволяет получать более четкоеокрашивание соединительной ткани, чем основной метод. Данную методику хорошо использовать при окраске железистой и других тканей. Окраска срезов лучше удается после сулемовых фиксаторов (жидкость Ценкера и её модификация по Максимову), можно и после простой формалиновой фиксации материала.

Приготовление растворов:

1. Раствор азокармина – к 100мл дистиллированной воды добавляют 0,1 г азокармина. Затем в течение нескольких минут кипятят и после охлаждения профильтровывают. К фильтрату добавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты.

2. Раствор анилинового синего и оранжевого G - к 100мл дистиллированной воды добавляют 0,5 г анилинового синего, 2,0 г оранжевого G. Смесь кипятят в течение 2-3 минут, охлаждают и профильтровывают. Перед употреблением раствор разводят в 2-3 раза дистиллированной водой.

3. Раствор анилинового спирта – в 100 мл 90% спирта растворяют 0,1 мл анилинового масла (практически удобнее 1,0 мл анилинового масла растворить в 1 л спирта).

4. Уксуснокислый спирт – к 100 мл 96% спирта добавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты.

5. Раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты – 5 мг химически чистого препарата растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

Окрашивание срезов проводят следующим образом:

1. Срезы переносят в раствор азокармина и помешают на 1,5- 2 часа в термостат с температурой 56-60 градусов. Срезы для этого помешают в хорошо закрывающиеся биологические стаканчики (или бюксы) с притертой пробкой.

2. Далее стаканчик со срезами охлаждают при комнатной температуре в течение 10-15 минут.

3. Срезы извлекают из стаканчиков (или бюкса), ополаскивают в дистиллированной воде.

4. Срезы переносят в раствор анилинового спирта и выдерживают до тех пор, пока не будут четко выявлены ядра (контроль под микроскопом). Если не удается долго выявить ядра, можно добавить в раствор дистиллированной воды, что ускорит процесс дифференцировки;

5. После дифференцировки ядер быстро промыть в течение 1-2 минуты уксуснокислым спиртом.

6. Протрава срезов в растворе фосфорно-вольфрамовой кислоты в среднем в течении 1-3 часов в зависимости от выявления элементов соединительной ткани под контролем микроскопа.

7. Ополаскивание в дистиллированной воде и переносят в разведенный раствор анилинового синего и оранжевого G – в течение 2-3 часов, после чего быстро ополаскивают в дистиллированной воде и переносят в 96% спирт для дифференцировки.

Результаты: при правильной дифференцировке коллагеновые и ретикулиновые волокна окрашиваются в синий цвет при отсутствии общего голубого тона, ядра клеток - в красный цвет. Мышечная ткань – в различные оттенки красно-оранжевого цвета.

 

Вариант 21. Методы исследования соединительных тканей. Импрегнация ретикулярных волокон серебром по способу Фута.

Фиксация материала в 15—20%-ном растворе формалина. После фиксации промывание в проточной воде 24—48 часов, а затем несколько часов в дистиллированной. Срезы получают на замораживающем микротоме. Работать только с химичес­ки чистыми реактивами, посуда безукоризненно чистая, пере­носят срезы только стеклянными иголками.

Необходимые материалы

0,25%-ный водный раствор марганцевокислого калия.

5%-ный раствор щавелевой кислоты.

2%-ный раствор азотнокислого серебра.

Раствор аммиачного серебра: на каждые 5 мл 10%-ного раствора AgNO3 прибавляют 4—5 капель 40%-ного водного раствора (гидрата окиси аммония) NH4OH. Образуется осадок (темно-бурый) гидрата окиси серебра. Осадок растворяют 25%-ным нашатырным спиртом, добавляя его по каплям, хорошо взбалтывая. На 5 мл 10%-ного AgNO3 необходимо 15—25 капель 25%-ного NH4OH.

Гидрат окиси аммония.

5%-ный раствор формалина.

0,5—1%-ный раствор хлорного золота.

5%-ный водный раствор гипосульфита.

Дистиллированная вода.

Ход окраски

1.Замороженные срезы из дистиллированной воды переносят в 0,25%-ный водный раствор марганцевокислого калия на 5—10 мин.

2.Споласкивают в водопроводной воде.

3.Выдерживают в 5%-ном растворе щавелевой кислоты 15—30 мин (до побеления срезов).

4.Тщательно промывают (20—30 мин) в большом количестве дистиллированной воды.

5.Выдерживают в темноте 48 часов в 2%-ном растворе азотнокислого серебра (AgNO3).

6.Быстро (3—5 сек) споласкивают в дистиллированной воде.

7.Выдерживают 15—20 мин в свежеприготовленном и профильтрованном растворе аммиачного серебра.

8.Споласкивают в дистиллированной воде (5—15 сек, вре­мя выбирают эмпирическим путем).

9.Помещают в 5%-ный раствор формалина на 15—30 мин

10.Тщательно промывают в водопроводной воде.

11.Перекладывают в 0,5— 1%-ный раствор хлорного золо­та (АиС13) на 5—10 мин.

12.Промывают в водопроводной воде (10—15 мин).

13.Обрабатывают в 5%-ном водном растворе гипосульфита 1—3 мин. Контролируют под микроскопом, споласкивая в воде.

14. Тщательно промывают в водопроводной воде — от нескольких часов до суток.

Ядра клеток докрашивают квасцовым кармином или гематоксилином.

Проводят через спирт, карбол-ксилол и заключают в бальзам. Результаты окраски: ретикулярные волокна черные, коллагеновые волокна фиолетовые, коричневые или серовато-черные.

 

ПРИЛОЖЕНИЕ 2