Работа 13. Биуретовая реакция на пептидную связь (Пиотровского)

Биуретовая реакция обусловлена наличием в белке пептидных связей, которые в щелочной среде образуют с сернокислой медью комплексы фиолетового цвета с красным или синим оттенком. Группа, образующая пептидную связь, в щелочной среде присутствует в своей таутомерной енольной форме:

О Н ОН

|| | |

– C – N – – C – N –

При избытке щелочи происходит диссоциация ОН-группы, появляется отрицательный заряд, с помощью которого кислород взаимодействует с медью, возникает солеобразная связь, кроме того, медь образует дополнительные координационные связи с атомами азота, участвующими в пептидной связи, путем использования их электронных пар. Возникающий таким образом комплекс очень стабилен. Интенсивность окраски комплекса зависит от концентрации белка и количества медной соли в растворе.

Биуретовой реакцией обнаруживаются все без исключения белки, а также продукты их неполного гидролиза – пептоны и полипептиды. Для ди- и трипептидов биуретовая реакция ненадежна. Оттенок зависит от длины полипептидной цепочки. Пептоны при этой реакции дают розовое или красное окрашивание. Биуретовая реакция положительна и с веществами небелкового характера, имеющими в составе не менее двух – CO – NH₂-групп, к ним относится, например, оксамид – NH₂ – CO – CO – NH₂, биурет – N₂H – CO – NH – CO – NH₂.

Исследуемый материал: раствор яичного белка, 1% -ный раствор желатины.

Реактивы: 10%-ный раствор NaOH, 1%-ный раствор CuSO₄.

Оборудование: пробирки, капельницы.

ХОД РАБОТЫ. К 5 каплям водного раствора белка добавляют 3 капли 10%-го раствора NaOH и 1 каплю 1%-го раствора CuSO₄ и перемешивают. Содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовый цвет. Нельзя добавлять избыток CuSO₄, так как синий осадок маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса.

Работа 14. Нингидриновая реакция на α-аминокислоты

Белки, полипептиды и свободные a-аминокислоты дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином. При нагревании белка с водным раствором нингидрина аминокислоты окисляются и распадаются, образуя СО₂, NH₃ и соответствующий альдегид. Нингидрин, являясь сильным окислителем, вызывает окислительное дезаминирование a-аминокислоты, приводящее к образованию аммиака, двуокиси углерода, соответствующего альдегида и восстановленной формы нмнгидрина. Нингидрин восстанавливается и связывается со второй молекулой нингидрина посредством молекулы аммиака, образуя продукты конденсации, окрашенные в синий, фиолетовый, красный, а в случае пролина – в желтый цвет.

Исследуемый материал: раствор яичного белка, 1% -ный раствор желатины.

Реактивы: нингидрин, 1%-ный водный раствор.

Оборудование: пробирки, капельницы.

ХОД РАБОТЫ. К 5 каплям раствора белка приливают 5 капель 0,1%-го водного раствора нингидрина и кипятят 1-2 мин. Появляется розово-фиолетовое окрашивание. С течением времени раствор синеет. Данная реакция не специфича, так как ее дают некоторые амины и амиды кислот.

Работа 15. Ксантопротеиновая реакция на циклические аминокислоты (Мульдера)

Ксантопротеиновая реакция открывает наличие в белках циклических аминокислот - триптофана, фенилаланина, тирозина, содержащих в своем составе бензольное ядро. Большинство белков при нагревании с концентрированной азотной кислотой дает желтое окрашивание, переходящее в оранжевое при подщелачивании. Реакция обусловлена нитрованием бензольного кольца этих аминокислот с образованием нитросоединений желтого цвета. При подщелачивании возникает хиноидная структура, окрашенная в оранжевый цвет.

Исследуемый материал: раствор яичного белка, 1% -ный раствор желатины.

Реактивы: концентрированная HNO₃, 10%-ный раствор NaOH.

Оборудование: пробирки, капельницы.

ХОД РАБОТЫ. К 5 каплям раствора белка добавляют 3 капли концентрированной HNO₃ и осторожно кипятят. Вначале появляется осадок свернувшегося белка (под влиянием кислоты), который при нагревании окрашивается в желтый цвет. После охлаждения в пробирку наливают по каплям 10%-го раствор NaOH до появления оранжевого окрашивания вследствие образования натриевой соли динитротирозина.