Биология аэробных спорообразующих бактерий

Классификация аэробных спорообразующих бактерий

По современным представлениям, аэробные спорообразующие бактерии, или бациллы, объединяются в отдельный род Bacillus семейства Bacillaceae. Этот род, включающий много разнообразных видов, имеет ряд характерных особенностей и отличается от других бактериальных организмов комплексом морфолого-физио-логических признаков, из которых наиболее важными являются палочковидная форма клеток, способность образовывать эндоспоры, потребность в свободном кислороде для роста.

Общая краткая характеристика объединяемых в род бацилл аэробных спорообразующих бактерий сводится к следующему.

Бациллы — свободноживущие, одноклеточные, нефотосинтезирующие, аэробные, палочковидные клетки, образующие типичные эндоспоры. Относятся к гетеротрофным организмам. Размножаются поперечным делением клеток. Ветвление и почкование клеток как способ размножения не отмечены. Поперечный размер клеток варьирует в пределах 0,4—2 мкм. Вегетативные клетки имеют вид прямых или слабоизогнутых палочек с параллельными сторонами и округлыми концами, которые в редких случаях резко обрезанные.

Расположение клеток различное — от одиночных до длинных цепочек. За исключением сибиреязвенного бацилла, бактерии этого рода подвижные, снабжены перитрихиально расположенными жгутиками.

Большинство видов является грамположительными бактериями, часть — грамвариабильными. Клетки хорошо окрашиваются обычными анилиновыми красками. Ни один представитель рода не является типично кислотоустойчивым организмом. У многих видов отмечается наличие внутриклеточного жира, гликогена, волю-тина и других включений. Капсула встречается лишь у сибиреязвенного бацилла и некоторых других видов при специфических условиях роста.

В бактериальных клетках в общем количестве оснований ДНК 32—65 мол.% гуанина и цитозина.

Большинство видов, исключая некоторые, главным образом энтомопатогенные, формы, хорошо растет на мясопептонном агаре (МПА) при реакции среды, близкой к нейтральной. Отдельные виды развиваются в щелочной среде и требуют особых источников азота или углерода.

Культуральные особенности видов, выросших на разных средах, резко различны. На твердых питательных средах образуются колонии от 1—2 до 5 мм и более в диаметре: гладкие, зернистые, пленчатые, складчато-морщинистые и сухие, слизеобразующие и пастообразные с характерной структурой края. При развитии на жидких средах обнаруживается тенденция к образованию поверхностной пленки. Встречаются виды, образующие на поверхности агаризованных сред подвижные колонии.

Большинство видов бактерий активно продуцируют ферменты, гидролизующие белки, крахмал и другие субстраты. Многие виды обладают антагонистическими свойствами и вырабатывают антибиотики полипептидной природы. Отдельные виды нуждаются в присутствии витаминов, аминокислот и других дополнительных факторов роста. Кислоту и газ продуцируют лишь бактерии некоторых видов, все остальные при росте на углеводах образуют одну кислоту. Оптимальная температура роста обычно варьирует в пределах 30—40° С. Встречаются виды, развивающиеся при температуре ниже 12° С и выше 50° С.

Некоторые аэробные бактерии — возбудители болезней. Вас. anthracis вызывает сибирскую язву у человека и животных; Вас. larvae — возбудитель американского гнильца медоносной пчелы; Вас. alvei и Вас. pulvifaciens трактуются как организмы, играющие определенную роль в болезнях пчел; Вас. popilliae и Вас. lentimorbus — возбудители молочной болезни японского жука; некоторые виды группы Вас. cereus-thuringiensis вырабатывают специфические энтомоцидные токсины.

Классификация видов аэробных спорообразующих бактерий разработана недостаточно полно. Одной из причин этого является ограниченность различий во внешних признаках бактерий. Известно, что большинство видов различаются между собой малозначимыми признаками строения и развития клеток, по форме колоний, а также физиологическим признакам. Многие вопросы биологии спороносных бактерий требуют глубоких исследований. Хорошо изучены только те виды, которые имеют практическое значение (патогенные, бродильные формы, продуценты различных антибиотиков, ферментов и т. д.). Вопросы систематики спорообразующих бактерий изучались специалистами прикладных наук для диагностических целей, в основном санитарно-гигиенического назначения.

Для выделения бактерий в самостоятельные виды одни авторы считают решающими ферментативные свойства организмов, другие — морфологические и культуральные признаки, третьи — цитологические особенности бактериальной клетки и т. д. Во всех подобных случаях принципы систематики меняются по мере выявления новых особенностей в строении и физиологических свойствах организмов и использования их в качестве признаков видовой идентификации. Систематика разных видов спорообразующих бактерий отражает степень их изученности, а следовательно, должна развиваться и изменяться по мере накопления новых данных.

Вопросы систематики бактерий представляют исключительную важность для работ по изысканию и изучению образования разнообразных физиологически активных веществ микробного происхождения. Биологический вид представляет единство специфических морфологических и физиолого-биохимических признаков организма, определяющих все особенности его жизнедеятельности, распространения и взаимодействия с внешней средой. В связи с этим образование того или иного продукта жизнедеятельности, как и характерные биологические особенности, невозможно представить в отрыве от видовой принадлежности микроорганизма.

Работы в области систематики спорообразующих бактерий и определения их положения в мире микроорганизмов начались еще до открытия спор у бактерий. Термин Bacillus на разных этапах развития микробиологии использовался вольно для обозначения как спороносных, так и неспороносных бактерий. В сущности, подобное положение сохранилось до наших дней, и мы нередко затрудняемся не только идентифицировать описанные виды, но и установить их истинную принадлежность к спорообразующим бактериям. Многие спорообразующие бактерии именовались различными авторами под родовыми названиями, которые в настоящее время служат обозначением родов неспороносных бактерий и других микроорганизмов, что еще более осложняет точное представление об описываемом организме.

Таксономия бактерий раннего периода в основном была конструктивной и имела диагностическое назначение. На этом этапе рассматривались подходы к созданию крупных систематических категорий.

По мере накопления фактического материала начали предпринимать попытки классификации по аналитическому принципу, учитывая родственные взаимоотношения микроорганизмов.

Систематика спорообразующих бактерий развивалась по мере эволюции взглядов на принципы дифференциации и идентификации микробных видов, а также усовершенствования методов морфолого-физиологического изучения бактерий.

Наиболее ранними в этом отношении были попытки микробиологов разграничить виды спорообразующих бактерий по морфологическим признакам, в частности по форме спор, способу их прорастания и т. п. Малозначимость этих признаков дифференциации и их неспецифичность привели к тому, что в дополнение к предыдущим описаниям было идентифицировано много новых видов, большинство из которых в последующем не были приняты или трактуются сейчас как синонимы других систематических категорий.

Широкое распространение спорообразующих бактерий в окружающей среде и их частое обнаружение в различных продуктах, особенно при порче, вызвали к ним определенный интерес. Первые работы по классификации этой группы бактерий были выполнены в основном представителями пищевой и санитарной микробиологии. При этом одни авторы основывались на морфологических признаках микроорганизмов, а другие — на физиологических. Классификация, основанная на различиях в способности аэробных спорообразующих бактерий сбраживать субстраты, предусматривала подразделение этих организмов на три группы по способности сбраживать глюкозу и образовывать ацетилметилкарбинол. Согласно другой классификации, которую в настоящее время используют наиболее часто, данный род бактерий разделяется на три группы по соотношению поперечных размеров спор и вегетативных клеток. Группа I — наиболее обширная — включает виды спороносных бактерий, у которых не отмечается отчетливого раздувания спорангия в процессе образования спор. Группа II объединяет бактерии, образующие овальные споры, раздувающие спорангий. Группа III охватывает бациллярные виды, характеризующиеся округлыми или шаровидными спорами, раздувающими спорангий; объединяет редко встречающиеся виды спорообразующих бактерий.

Вопросы классификации различных видов аэробных спорообразующих бактерий разрабатывались многими отечественными авторами. Особенно тщательно были изучены морфолого-физиологические особенности отдельных групп и видов этих бактерий Е. Н. Мишустиным с сотрудниками. Данные этих исследований свидетельствуют о большом многообразии видов и экологических разновидностей спорообразующих бактерий в зависимости от мест их обитания, почвенно-климатической зональности и микробного ценоза разных типов почв.

В настоящее время для определения видов спорообразующих бактерий наряду с морфоло-го-физиологическими особенностями используют и многие другие признаки.

Важными критериями для определения и дифференциации бактерий являются отношение к действию специфичных фагов, агглютинация с гомологичными сыворотками к споровому, соматическому и жгутиковому антигенам, рост при высокой концентрации солей, различной температуре и т. п. Многие отмеченные особенности применяются для внутривидового подразделения и выделения культур спороносных бактерий в отдельные разновидности, серотипы и другие мелкие систематические подразделения. В ряде случаев некоторые признаки служат основой для выделения культур спорообразующих бактерий в новые виды. Так, например, в качестве новых видов описаны психрофильные, развивающиеся при низкой температуре культуры спорообразующих бактерий. Подобным же образом выделены некоторые активные продуценты амилолитических и целлюлолитических ферментов. В литературе было описано много новых видов бацилл, патогенных для некоторых насекомых, растений и животных, что в большинстве случаев не подтвердилось в последующие годы.

Успехи в области создания счетно-вычислительной техники дали основу для быстрой математической обработки данных по родству и отдаленности организмов. Применение этой техники в бактериальной таксономии получило название числовой таксономии и было введено в микробиологию в последние годы. Числовая таксономия рассматривает группирование и идентификацию организмов с учетом их подобия при анализе не менее чем 50—60 объективных признаков. Этот метод с разработкой схем подобия и разграничения уже использован рядом авторов для систематики различных видов спороносных бактерий.

Особого внимания заслуживает разработка новых подходов к трактовке вопросов филогенетической таксономии бактерий с помощью биохимических исследований. Наибольший интерес в этом отношении представляют попытки классификации бактерий с использованием новейших данных молекулярной биологии.

Клетки аэробных спорообразующих бактерий имеют палочковидную форму и в сравнении с неспороносными бактериями, как правило, более крупных размеров. Вегетативные формы спороносных бактерий обладают более слабым активным движением, хотя им присущи пери-трихиально расположенные жгутики. Длина клеток вегетативных форм варьирует, особенно в зависимости от возраста культуры. У некоторых видов спороносных бактерий в старых культурах отмечается образование характерных полиморфных форм. Размеры и форма бактериальных клеток подвергаются значительным изменениям в процессе образования спор, что во многих случаях может служить дополнительным признаком для распознавания отдельных видов. В молодых культурах содержимое клеток однородно, по мере старения гомогенность исчезает, появляется зернистость. При этом отмечается значительное накопление внутриклеточного жира, который выявляется при специфическом цитохимическом окрашивании в виде зерен различной формы. Количество и характер свободного внутриклеточного жира различны у разных видов спороносных бактерий и, по мнению ряда авторов, могут быть использованы для определения видовой и групповой принадлежности бактерий.

Форма и величина спор — постоянные признаки — имеют первостепенное значение при групповом и видовом разграничении спорообразующих бактерий. Немаловажное значение при этом придается соотношению поперечных размеров спор и клеток, а также локализации спор. Спорулирующая клетка, или спорангий, у отдельных видов бактерий раздувается в месте расположения спор, если поперечник спорангия больше поперечника клетки. В зависимости от расположения спор, раздувающих спорангий, клетки принимают либо плектридиальную, либо клостридиальную форму.

Споры бактерий в благоприятных условиях прорастают, причем в характере прорастания отмечается постоянство, присущее определенным видам. Различают полярное и экваториальное прорастание спор. Как редкое исключение наблюдается косое прорастание. Сказанное относится к спорам продолговатой формы. Наблюдения показали, что некоторые виды бактерий имеют строго определенный тип прорастания спор; у отдельных видов наблюдаются и отклонения. Помимо места, откуда происходит прорастание, для различных видов характерными являются отдельные цитологические изменения, происходящие в процессе прорастания и сбрасывания (разрывания или пробивания) оболочки споры. Эти особенности прорастания спор впервые были отмечены в конце прошлого столетия И. И. Мечниковым.

Для различных видов спороносных бактерий характерны культуральные особенности роста на питательных средах. При росте на твердых средах на поверхности образуются своеобразные скопления клеток в виде отдельных бактериальных колоний. Строение колоний зависит от состава питательной среды и условий культивирования, особенностей биохимической деятельности и химического состава бактерий, интенсивности их роста, особенностей движения после деления.

Форма поверхности колоний спорообразующих бактерий самая разнообразная: гладкая жирноблестящая, плоская зернистая или крупинчатая, пленчатая влажноблестящая, сухая мучнистая, складчато-морщинистая и т. п. Один и тот же вид спороносных бактерий образует на средах различного состава разнообразные колонии. Поэтому при описании культуральных особенностей выращиваемых бактерий строго придерживаются определенного состава питательных сред и условий выращивания.

Для большинства спорообразующих бактерий очень подходящи среды, содержащие усвояемые углеводные и сложные органические соединения. С этой целью успешно могут быть использованы мясо-пептонный агар с глюкозой, сахарозой (1—2%), сусло-агар и т. п. Некоторые виды спорообразующих бактерий образуют на твердых питательных средах подвижные колонии. Природа этого явления пока недостаточно изучена, но показано, что оно связано с усиленной подвижностью клеток и некоторыми физико-химическими особенностями питательной среды.

Важным диагностическим признаком для определения видов спороносных бактерий является строение края колоний. Одни виды образуют колонии с ризоидными, бахромчатыми и ветвистыми краями, другие — с гладкими округлыми или бугристыми, грубо волнистыми. Подобные особенности в ряде случаев удается подметить невооруженным глазом, но особенно хорошо они выявляются при микроскопии с небольшим увеличением.

Консистенция бактериальных колоний весьма разнообразна. Культуры группы картофельного и сенного бацилла характеризуются образованием плотных, вросших в агар, сухих морщинистых колоний. У других видов бактерий колонии пастообразные или слизеобразу-ющие, гладкие. Образование пигментов у спорообразующих бактерий отмечается сравнительно редко. Некоторые культуры бактерий при росте на белковых средах приобретают бурую пигментацию, диффундирующую в субстрат. Подобное окрашивание не связано с образованием пигмента, а вызвано продуктами распада сложных органических соединений.

При культивировании сибиреязвенного бацилла на жидких средах отмечается выделение пигментов красного и бурого цвета. У отдельных культур сенного бацилла и некоторых других видов наблюдается образование красного пигмента, который был идентифицирован как пульхеримин и пульхериминовая кислота.

При росте на жидких питательных средах одни виды спороносных бактерий образуют поверхностную пленку, другие — нет. Культуры Вас. mycoides образуют характерную паутиновидную пленку, которая в пробирке располагается в форме конуса основанием вверх. Культуры бактерий, характеризующиеся образованием поверхностной пленки, при потере спорообразования лишаются этой способности.

Культуральные особенности роста различных видов спорообразующих бактерий, равно как и других микроорганизмов, отражают их характерные физиолого-биохимические свойства, особенности деления, размножения и расположения клеток. Отличительные особенности распределения клеток в процессе их размножения в колониях бактерий на-иболее четко выявляются при наблюдении в сканирующем микроскопе (табл. 37). Аэробные спорообразующие бактерии относятся к гетеротрофам, т. е. к микроорганизмам, нуждающимся в готовых органических соединениях. Для огромного большинства споро-образующих бактерий лучшими источниками азотного питания являются белки и аминокислоты сложных органических соединений. На средах с минеральными соединениями азота большинство этих бактерий развивается слабо.

Спорообразующие бактерии обладают активными протеолитическими ферментами. Они разлагают сложные белковые соединения на аминокислоты, а затем и на более простые азотистые вещества и аммиак. Способность спорообразующих бактерий к энергичному разложению сложных органических соединений до простых продуктов распада стала основой для физиологической характеристики этой группы бактерий как активных аммонификаторов. Однако различные виды спорообразующих бактерий по-разному относятся к источникам азотистого питания. Так, например, культуры группы сенного и картофельного бацилла более энергично сбраживают углеводы с образованием разнообразных промежуточных соединений. Для наиболее распространенных видов спорообразующих бактерий лучшими источниками азотного питания оказались пептон, гидролизат казеина, автолизат дрожжей и мочевина.

Среди почвенных аэробных спорообразующих бактерий имеются виды, которые довольно хорошо развиваются на безазотистой среде. К ним относятся олигонитрофильные бактерии, обладающие способностью усваивать атмосферный азот. Эти микроорганизмы характеризуются слабой азотфиксирующей способностью, однако их накопление в почве может значительно содействовать обогащению ее азотом. В этом отношении всестороннее изучение данной группы микроорганизмов представляет большое значение для повышения плодородия почв.

Большинство видов спорообразующих бактерий, широко распространенных в почве, обладает способностью использовать в качестве источника азота нитраты. Благодаря этому они вызывают процессы восстановления нитратов (денитрификацию) и переводят их в состав органических азотистых соединений. Таким образом, спорообразующие бактерии усваивают азот из различных источников в неодинаковой степени. Одни предпочитают аммонийный азот, другие — азот аминокислот; многие хорошо потребляют азот нитратов, тогда как некоторыми он не усваивается или используется слабо.

Активная аммонифицирующая деятельность спорообразующих бактерий имеет важное значение для повышения плодородия почв. Некоторые авторы отметили заметное увеличение урожайности растений при внесении в почву активных аммонификаторов. Спорообразующим бактериям принадлежит важная роль в превращениях фосфора. Многими авторами было показано, что культуры различных видов спороносных бактерий активно переводят нерастворимые фосфорные соединения в растворимые. В Советском Союзе с применением культуры спорообразующих бактерий, активно минерализующей сложные органические соединения фосфора, было налажено промышленное производство бактериального удобрения — фосфобактерина. Этот препарат широко и успешно применялся для повышения урожайности многих сельскохозяйственных культур.

Установлено несколько механизмов разложения фосфорных соединений спороносными бактериями. В одном случае происходит растворение трикальцийфосфата, в другом — перевод фосфоритов в апатиты или фосфитов в фосфаты. Более распространенным является минерализация органофосфатов в результате ферментативной деятельности бактерий и выделения ими кислот. Результаты исследований показывают, что отмеченные свойства не приурочены к особым видам, обнаруживаются у культур многих видов и разновидностей спороносных бактерий, а также других микроорганизмов.

Отечественными авторами были выделены и изучены культуры спорообразующих бактерий, способные разрушать полевые шпаты, каолин и другие формы силикатов.

Среди спорообразующих бактерий обнаружены виды и разновидности, характеризующиеся выраженной специализацией биохимической активности. Так, культуры Вас. pasteurii обладают уреазной активностью и хорошо развиваются в сильно щелочной среде. Редкой формой бациллярных организмов является Вас. fastidiosus, который не способен усваивать сахара, аминокислоты, белковые и другие соединения. Бактерии этого вида потребляют лишь мочевую кислоту и аллантоин.

В качестве источника углеродного питания спорообразующие бактерии могут использовать как простые сахара, так и полисахариды. Из моносахаридов лучше всего они усваивают глюкозу, а из дисахаридов — сахарозу. Отношение разных видов спорообразующих бактерий к углеводам различное, что широко используется в исследованиях по систематике для определения видовой принадлежности микроорганизмов. При развитии на простых сахарах, в особенности на глюкозе, спорообразующие бактерии синтезируют ряд продуктов — молочную, уксусную и пропионовую кислоты, ацетилметилкарбинол и т. п. Газообразование отмечается только у культур нескольких видов. Многие виды спорообразующих бактерий сравнительно хорошо усваивают различные органические кислоты и спирты.

В группе аэробных спорообразующих бактерий немало видов и разновидностей, которые для своего роста и развития нуждаются в различных витаминах, аминокислотах и других ростовых факторах. Так, для культур сибиреязвенного бацилла наряду с аминокислотами необходим тиамин. Культуры облигатных энто-мопатогенных видов — возбудителей молочной болезни японского жука, американского гнильца медоносной пчелы и других болезней насекомых — нуждаются во многих аминокислотах и витаминах.

Культуры сапрофитных спорообразующих бактерий также в ряде случаев проявляют специфические потребности в витаминном и аминокислотном питании. Наиболее характерной для подобных организмов является зависимость их роста и развития от наличия в среде тиамина, биотина, фо-лиевой и никотиновой кислот. В качестве обособленного нового вида описаны культуры спорообразующих бактерий, нуждающиеся в пан-тотеновой кислоте. Термофильным формам спороносных бактерий присуща более выраженная зависимость роста и развития от аминокислот, витаминов и других дополнительных факторов роста.

Спорообразующие бактерии — активные продуценты многих ферментов.

Бактерии группы сенного и картофельного бацилла обладают выраженной протеолитиче-ской и амилолитической активностью. В настоящее время культуры этих видов спороносных бактерий широко используются во многих странах для промышленной выработки амилазы и различных протеаз. С давних времен в Японии большой популярностью пользуется национальное блюдо «натто», которое изготовляют из соевых бобов при их обработке культурой сенного бацилла.

Некоторые виды спорообразующих бактерий вырабатывают ферменты, разлагающие пектин и протопектин растений. Этим бактериям при-писывается определенная роль в создании комковатой структуры почв и в образовании клубеньков у бобовых растений.

Выраженные ферментативные свойства некоторых видов спорообразующих бактерий обусловливают развитие гнилей и побурение плодов, фруктов и других растительных продуктов. При благоприятных условиях размножения некоторых видов бацилл — продуцентов фосфолипаз и других ферментов — вызывается порча пищевых продуктов, которые могут служить причиной гастроэнтеритов и других пищевых отравлений.

Среди бактериальных организмов группа аэробных спорообразующих бактерий известна своими сильно выраженными антагонистическими свойствами в отношении большого числа микроорганизмов. Спороносные бактерии можно поставить в один ряд с лучистыми грибками, пенициллами и аспергиллами, представляющими собой основные источники получения антибиотических веществ.

Подавляющее большинство антибиотиков бактериального происхождения выделено из группы спорообразующих бактерий. Первый антибиотический препарат — грамицидин — выделен из культуры спороносной бактерии. Советскими учеными был получен антибиотик грамицидин С, который успешно используется при лечении многих инфекций. Из различных видов бацилл получены антибиотики альвеин, бациллин, бацитрацин, лихениформин, субтилин, циркулин и др. Особый интерес вызвало открытие полимиксинов — антибиотиков бациллярного происхождения, которые оказались высокоактивными против грамотрицательных бактерий. В ряде стран организовано промышленное производство отдельных препаратов антибиотиков: полимиксина В, колистина, бацитрацина.

Кроме терапевтического использования, бацитрацин применяется в качестве стимулятора роста животных.

В настоящее время из различных видов спорообразующих бактерий выделено более 60 антибиотиков, из которых некоторые были испытаны в клинической практике. Однако антибиотики, полученные из спорообразующих бактерий, изучены недостаточно.

За некоторыми исключениями, антибиотики из спорообразующих бактерий представляют собой вещества белковой природы — полипептиды. Они состоят из различных аминокислот, причем наиболее характерным является то, что в состав полипептидных антибиотиков входят неестественные аминокислоты с правой оптической конфигурацией. Некоторые антибиотики полипептидной природы имеют сравнительно более простой состав и несложную формулу, представляя весьма удобную модель для изучения строения белка. С другой стороны, полипептидные антибиотики привлекают большой интерес биохимиков, так как эти вещества могут быть использованы при изучении одной из центральных проблем современной биологии — выяснении причин, обусловливающих специфичность биологически активного белка.

По механизму действия продуцируемые спорообразующими бактериями антибиотики разделяются на три группы. Группа эдеинов, представляющих собой пептиды с сильно основными свойствами, специфически подавляет синтез ДНК. Группа бацитрацинов и родственных им антибиотиков представляет собой циклические пептиды, которые угнетают синтез оболочки клеток. В обширную группу бациллярных антибиотиков включают грамицидины, поли-миксины и родственные им соединения, которые специфически блокируют синтез структурных компонентов или функцию клеточной мембраны. Характерной особенностью этих антибиотиков является то, что они образуются после активного размножения бактерий в процессе спорообразования. Результаты генетических исследований свидетельствуют, что биосинтез бациллярных антибиотиков тесно связан с образованием протеазы, характерной для процессов спорообразования. Поэтому синтез антибиотиков отражает особенности биохимической дифференциации клеток спорообразующих бактерий.

Спорообразующие бактерии широко распространены в природе и играют большую роль в биологии почвы; изучение антагонистических свойств спороносных бактерий внесет много ценного в наши представления о роли антагонизма микробов в процессах самоочищения почвы, воды и других природных субстратов.