Методы лабораторной диагностики

А. Бактериологическая диагностика (рис. 3):

Выделить возбудителя туберкулеза в чистом виде трудно. Успех во многом зависит от исследуемого материала.

1. Материал для исследования:

- в ветеринарии основным материалом являются пораженные органы после убоя животных; а также мокрота, гной, кал, молоко и др.

Для освобождения от посторонней микрофлоры исследуемый материал обрабатывают 6-10% раствором серной кислоты (метод Гона) не более 25-30 минут.

Для обработки жидкого, полужидкого, кашицеобразного материала и соскобов с объектов среды обитания животных используют метод флотации. Сущность метода заключается в том, что исследуемый материал взбалтывают в колбе вместе с углеводородами (бензол, бензин и др.), а всплывающий слой пены – флотат, содержащий микобактерии туберкулеза, используют для приготовления мазков, посевов на питательные среды, заражения лабораторных животных.

Аллергическая диагностика туберкулеза. Ведущее место в прижизненном распознавании туберкулеза у животных и птиц занимает аллергическая диагностика с использованием туберкулина. В настоящее время основным прижизненным методом исследования животных на туберкулез служит внутрикожная туберкулиновая проба. Туберкулин для млекопитающих изготавливают из штаммов только бычьего вида.

Для внутрикожной пробы применяют сухой очищенный туберкулин (протеин пурифиед дериват – ППД). ППД был предложен М.А. Линниковой для медицинской практики. В ветеринарии используют стандартизированный сухой очищенный туберкулин для млекопитающих.

Сухой очищенный туберкулин (ППД) для птиц готовят по той же технологии, что и ППД для млекопитающих, – из культурального фильтрата микобактерий туберкулеза птичьего вида и применяют для диагностики у птиц и свиней.

Туберкулин вводят внутрикожно крупному рогатому скоту, буйволам, зебу, верблюдам, оленям – в область средней трети шеи, свиньям – наружной поверхности основания уха, курам – в бородку.

Учитывают реакцию через 72 ч по результатам измерения толщины кожной складки с учетом характера образовавшейся припухлости. При положительной реакции появляется разлитой отек размером 35х45 мм и больше, без строго очерченных границ, тестообразной консистенции, с повышенной местной температурой и чувствительностью (болезненность). Кожная складка увеличивается на 3 мм и более. Кожную складку измеряют с помощью кутиметра и по разнице между показателем толщины возникшей припухлости и складки неизмененного участка кожи устанавливают степень увеличения.

Курам туберкулин вводят внутрикожно в одну бородку, вторая служит контролем. Реакцию учитывают через 30-36 ч. Положительная реакция проявляется в виде опухания бородки, она утолщена, тестообразна, горячая и отвисает книзу.

Кроме внутрикожной пробы в определенных случаях используют глазную, подкожную и внутривенную пробы.

2. Микроскопия:

а) Методы окраски: по Циль-Нильсену, люминесцентная микроскопия.

Метод окраски по Циль-Нильсену (для кислотоустойчивых бактерий):

1) раствор карболового фуксина (при подогревании)до 10 мин

2) 3-5%-ный раствор серной кислоты 5-7 с

3) промыть водой

4) раствор метиленовой сини 5 мин

Люминисцентная микроскопия - основана на способности микобактерий окрашиваться люминесцентными красителями (родамин-аурамином) и давать золотисто-желтый цвет под воздействием ультрафиолетового излучения.

Кислотоустойчивые бактерии (возбудитель туберкулеза) окрашивается в красный цвет (не обесцвечиваются кислотой), остальные – в синий.

б) микрокартина (фото 4): тонкие прямые или слегка изогнутые палочки от 1,5 до 5 мкм с закругленными краями;

в) грамположительные;

г) спор не образуют;

е) неподвижны;

ж) кислото-спирто-щелочеустойчивые.

Рис. 3. Схема лабораторной диагностики туберкулеза

Фото 4.Возбудитель туберкулеза окраска по Циль-Нильсену.

3. Культивирование:

а) посев на питательные среды:

- глицериновые (используют для пересева и выделения чистых культур) – ГМПА и ГМПБ (глицерин - лучший источник углерода: прибавление его в мясной бульон и агар вызывает обильный рост культур.)

- яичные (для первичного выделения культур)– среда Петраньяни, Левенштейна-Йенсена, Гельберга и др.

- синтетические (для изучения биохимических свойств микобактерии и других целей) ‒ безбелковые среды Сотона, Моделя;

б) особенности выделения возбудителя:

- аэробы,

- оптимальная температура 37-38°С для человеческого, 38-39°С для бычьего, 39-41°С для птичьего вида.

- срок культивирования от 7 до 30 дн.

в) культуральные свойства:

- на жидких средах – образуют как поверхностный, так и придонный рост с наличием бугристой, морщинистой пленки крошкообразной консистенции, имеющей желтовато-коричневый, кремовый или бурый цвет. (рис. 14.4.) В микрокультурах, развивающихся в жидких питательных средах, микобактерии человеческого и бычьего видов образуют косы, жгуты, завитки, скопления.

- на плотных средах – сливающиеся бугристые колонии, которые могут иметь гладкую блестящую или шероховатую поверхность(бородавчатые колонии), а также сплошной морщинистый налет белого, или белого с желтоватым оттенком, или же другого цвета (фото 14.5.);

г) биохимические свойства:

- изучают для идентификации возбудителя, а также для дифференциации от кислотоустойчивых сапрофитов,

- включают в себя тесты – скорость роста, образование пигмента (на свету и в темноте), ферментативную активность. Микобактерии туберкулеза содержат различные ферменты:

-эстераза и липаза расщепляют жиры;

-дегидраза – органические кислоты, в том числе аминокислоты;

- уреаза – мочевину,

-перигалола – углеводы,

-каталаза – перекись водорода;

-протеолитические ферменты (протеаза) – белок.

д) антигенная структура:

-микобактерии туберкулеза содержат полисахаридо-белково-липоидный комплекс, названный полным антигеном. При парентеральном введении у животных наблюдают образование антител, которые выявляют в серологических реакциях – РА, РП, РСК и др.

-туберкулины также относятся к антигенам.