Активный транспорт веществ. Опыт Уссинга

Активный транспорт веществ через биологические мембра­ны имеет огромное значение. За счет активного транспорта в организме создаются градиенты концентраций, градиенты электрических потенциалов, градиенты давления и т.д., под­держивающие жизненные процессы, то есть с точки зрения тер­модинамики активный перенос удерживает организм в нерав­новесном состоянии, поддерживает жизнь.

Существование активного транспорта веществ через биоло­гические мембраны впервые было доказано в опытах Уссинга (1949 г.) на примере переноса ионов натрия через кожу лягушки.

Экспериментальная камера Уссинга, заполненная нормаль­ным раствором Рингера, была разделена на две части свежеизо­лированной кожей лягушки: наружная мукозная поверхность кожи и внутренняя - серозная. Наблюдались потоки ионов натрия через кожу лягушки: слева направо от наружной к внутренней поверхности и справа нале­во от внутренней к наружной поверхности.

Из уравнения Теорелла, описывающего пассивный транс­порт, следует уравнение Уссинга-Теорелла для отношения этих потоков в случае пассивного транспорта:

J_{m вн/}J_{m нар=}с_нар/С_вн

На коже лягушки, разделяющей раствор Рингера, возникает разность потенциалов         (φ_вн - φ_нар) - внутренняя сторона кожи име­ет положительный потенциал по отношению к наружной. В уста­новке Уссинга имелся блок компенсации напряжения, с помощью которого устанавливалась разность потенциалов на коже лягушки, равная нулю, что контролировалось вольтметром.

Кроме того, поддерживалась одинаковая концентрация ионов с наружной и внутренней стороны С_нар = С_вн.

При этих условиях, если бы перенос натрия через кожу ля­гушки определялся только пассивным транспортом, то согласно уравнению Уссинга-Теорелла потоки ϳ_m,вн и j_m.нар       были равны друг другу:

ϳ_m,вн = j_m.нар

Суммарный поток через мембрану был бы равен нулю.

Однако, обнаружено с помощью амперметра, что в условиях опыта (отсутствие градиентов электрического потенциала и кон­центрации) через кожу лягушки течет электрический ток I, сле­довательно происходит односторонний перенос заряженных ча­стиц. Установлено, что ток через кожу течет от внешней среды к внутренней.

Методом меченых атомов было показано, что поток натрия внутрь больше потока наружу ϳ_m,вн › j_m.нар • Для этого в левый раствор экспериментальной камеры были включены радиоак­тивные изотопы Nа²², а в правый - Nа²⁴. Изотоп Nа²² распадает­ся с излучением жестких ᵧ-квантов. Распад Nа²⁴ сопровожда­ется мягким ᵦ-излучением. Регистрация ᵧ и ᵦ -излучения показала, что поток Nа²² больше потока Nа²⁴.

Эти экспериментальные данные неопровержимо свидетель­ствовали о том, что перенос ионов натрия через кожу лягушки не подчиняется уравнению пассивного транспорта. Следова­тельно, имеет место активный перенос.

Электрогенные ионные насосы.

Согласно современным представлениям, в биологических мембранах имеются ионные насосы, работающие за счет сво­бодной энергии гидролиза АТФ, - специальные системы интег­ральных белков (транспортные АТФазы).

В настоящее время известны три типа электрогенных ион­ных насосов, осуществляющих активный перенос ионов через мембрану (рис. 2.11).

Перенос ионов транспортными АТФазами происходит вслед­ствие сопряжения процессов переноса с химическими реакци­ями, за счет энергии метаболизма клеток.

При работе К⁺- Na⁺-АТФазы за счет энергии, освобождающей­ся при гидролизе каждой молекулы АТФ, в клетку переносится два иона калия и одновременно из клетки выкачиваются три иона натрия. Таким образом, создается повышенная по сравне­нию с межклеточной средой концентрация в клетке ионов ка­лия и пониженная натрия, что имеет огромное физиологичес­кое значение.

В Са²⁺-АТФазе за счет энергии гидролиза АТФ переносятся два иона кальция, а в Н⁺-помпе - два протона.

Молекулярный механизм работы ионных АТФаз до конца не изучен. Тем не менее прослеживаются основные этапы этого сложного ферментативного процесса. В случае К⁺- Na⁺- АТФазы (обозначим ее для краткости Е) насчитывается семь этапов пере­носа ионов, сопряженных с гидролизом АТФ. Обозначения Е¹ и Е² соответствуют расположению активного центра фермента на внутренней поверхности мембраны соответственно (аденозиндифосфат - АДФ, неорганический фосфат - Р, звездочкой обозна­чен активный комплекс):

1) Е+АТФ→Е ٭ АТФ,

2) Е ٭ АТФ+3Na→[Е ٭ АТФ] ٭ Na₃,

3) [Е ٭ АТФ] ٭ Na₃→[Е ¹ ̴ Р] ٭ Na₃+АДФ,

4) [Е ¹ ̴ Р] ٭ Na₃→[Е ² ̴ Р] ٭ Na₃,

5) [Е ² ̴ Р] ٭ Na₃+2К→[Е ² ̴ Р] ٭ К₂+3Na,

6) [Е ² ̴ Р] ٭ К₂→[Е ¹ ̴ Р] ٭ К₂,

7) [Е ¹ ̴ Р] ٭ К²₂→Е+Р+2К

На схеме видно, что ключевыми этапами работы фермента являются: 1) образование комплекса фермента с АТФ на внут­ренней поверхности мембраны (эта реакция активируется иона­ми магния); 2) связывание комплексом трех ионов натрия; 3) фосфорилирование фермента с образованием аденозиндифосфата; 4) переворот (флип-флоп) фермента внутри мембраны; 5) реакция ионного обмена натрия на калий, происходящая на внешней поверхности мембраны; 6) обратный переворот ферментного комплекса с переносом ионов калия внутрь клетки и 7) возвращение фермента в исходное состояние с освобождени­ем ионов калия и неорганического фосфата (Р). Таким образом, за полный цикл происходят выброс из клетки трех ионов на­трия, обогащение цитоплазмы двумя ионами калия и гидролиз одной молекулы АТФ.