Глава IIi Оценка эффективности методов защиты человека от приоритетных поллютантов

 

Для оценки эффективности методов защиты человека от приоритетных поллютантов, представляющих сочетание витаминопрофилактики и адаптацию к нормобарической гипоксии, были предложены следующие методики, характеризующие антиоксидантный статус организма человека.

Среди них можно определить три основные группы:

· оценка свободнорадикального окисления липидов в сыворотке крови;

· содержание витаминов-антиоксидантов (А,Е и С);

· активность основных ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы и каталазы).

Кроме того, могут быть определены дополнительные показатели:

· оценка липидного спектра в сыворотке крови;

· оценка активности органоспецифических ферментов в сыворотке крови.

Методы оценки эффективности защиты человека от воздействия приоритетных поллютантов

Метод оценки свободнорадикального окисления липидов

Для оценки интенсивности процессов свободнорадикального окисления липидов у обследованных лиц применяется спонтанная и железоиндуцированная хемилюминесценция цельной сыворотки крови.

Методика оценки свободнорадикального окисления липидов в цельной сыворотке крови

Для исследования хемилюминесценции цельной сыворотки крови необходимо забрать венозную кровь без ЭДТА и без гепарина. Выдержать 30 минут, после чего центрифугировать при 1500 об/мин в течение 15 минут. Полученную сыворотку развести фосфатным буфером рН=7,45. Состав буфера: 2,72 г KH2PO4, 7,82 г КСl на 1 литр дистиллированной воды. Величину рН полученного раствора, в соответствие с методикой, довести до 7,45 ед. титрованием насыщенным раствором КОН.

Определение спонтанной и железоиндуцированной хемилюминесценции проводят отобрав 0,5 мл полученной сыворотки крови разведенной в 20 мл фосфатного буфера. Пробу поместить в кюветную камеру прибора «Хемилюминометр-3». В пробу для инициирования свечения ввести 1 мл 25 мМ раствора сернокислого железа.

При оценке наблюдаемой вспышки хемилюминесценции выделить несколько основных параметров:

h - высоту быстрой вспышки, зависящую от содержания в изучаемой системе гидроперекисей липидов;

Н - высоту медленной вспышки, отражающую способность липидов к перекисному окислению, максимальную интенсивность ПОЛ после введения Fe²⁺;

S - светосумму медленной вспышки, определяемую как площадь под кривой от начала медленной вспышки до достижения ею максимального значения, оценивающую число боковых цепей разветвления, т.е. сколько на 1 ион Fe²⁺ приходится образовавшихся перекисных радикалов (RООя);

tg б – тангенс угла наклона медленной вспышки, определяет скорость окисления липидов; ф – латентный период (в с) от момента введения железа (II) до достижения концентрации Fe2+ критической величины, латентный период зависит от соотношения в системе про- и антиоксидантов.

Критерии оценки (показатели в пределах нормы):

Спонтанная светимость 0,27 - 0,37 у.е.,

Вспышка 0,77 – 0,87 у.е.,

Светосумма 2,70 - 3,10 у.е.,

Максимальная светимость 0,85 – 1,10 у.е.,

Наклон 0,24 – 0,32 у.е.

Исследование хемилюминесценции суммарной фракции апо-В ЛП (ЛПНП и ЛПОНП) сыворотки крови

Для исследования хемилюминесценции цельной сыворотки крови необходимо забрать венозную кровь без ЭДТА и без гепарина. Выдержать 30 минут, после чего центрифугировать при 1500 об/мин в течение 15 минут. Суммарную фракцию апо-В ЛП (ЛПНП и ЛПОНП) сыворотки крови выделить осаждением в присутствии гепарина и хлорида кальция двухвалентного. Для выделения фракции апо-В ЛП к 2 мл 15 мМ раствора CaCl₂ добавить 0,2 мл сыворотки крови и 0,04 мл 1% раствора кристаллического гепарина. Образовавшуюся суспензию инкубировать 5 минут при комнатной температуре. После инкубирования пробы центрифугировать пять минут при 2000g. Надосадочную жидкость удалять. Осадок представляет собой суммарную фракцию липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП). К осадку добавить 0,85% раствор хлорида натрия и гомогенизировать до образования суспензии апо-В ЛП.

Полученную суспензию в смеси с фосфатным буфером (1:8 мл) поместить в кювету хемилюминесцентной установки. Для инициирования свечения в пробу ввести 1 мл 25 мМ раствора сернокислого железа.

При оценке наблюдаемой вспышки хемилюминесценции выделить основные параметры:

h - высоту быстрой вспышки, зависящую от содержания в изучаемой системе гидроперекисей липидов;

Н - высоту медленной вспышки, отражающую способность липидов к перекисному окислению, максимальную интенсивность ПОЛ после введения Fe²⁺;

S - светосумму медленной вспышки, определяемую как площадь под кривой от начала медленной вспышки до достижения ею максимального значения, оценивающую число боковых цепей разветвления, т.е. сколько на 1 ион Fe²⁺ приходится образовавшихся перекисных радикалов (RООя);

tg б – тангенс угла наклона медленной вспышки, определяет скорость окисления липидов; ф – латентный период (в с) от момента введения железа (II) до достижения концентрации Fe2+ критической величины, латентный период зависит от соотношения в системе про- и антиоксидантов.

Критерии оценки (показатели в пределах нормы):

Спонтанная светимость 0,21 - 0,35 у.е.,

Вспышка 0,36 – 0, 50 у.е.,

Светосумма 1,70 - 2,70 у.е.,

Максимальная светимость 0,69 – 1,00 у.е.,

Наклон 0,18 – 0,32 у.е.