Методы механического разрушения клеток

Разрушение со стеклянными бусами. Растирают микроорганизмы с прочной клеточной стенкой — дрожжи. Метод основан на механическом растирании клеток, попадающих между двумя мелкими стеклянными шариками. На 1 г клеточной массы добавляют 1-3 г отмытых охлажденных шариков.

Френч-пресс. Основан на перепаде давления от высокого (1550-1400) к низкому (атмосферному). Перепад давления взрывает клетки изнутри. Контролируют полноту разрушения микроскопически или по увеличению вязкости жидкости (в результате выхода ДНК).

Обработка ультразвуком. При этом разрушении происходит механический разрыв клеток за счет вибрации. Необходим строгий контроль за нагревом излучателя и температурой материала. Излучатель охлаждают холодной проточной водой, а пробу — в воде со льдом. Для усиления эффекта используют абразивы. Полноту разрушения контролируют микроскопически. Актиномицеты, грибы и дрожжи разрушаются с трудом.

Лизис клеток в присутствии органических растворителей. Используют невысокую концентрацию (0,1-1,0%) толуола. Применяют для микроорганизмов, осажденных на фильтрах.

Лизис клеток с помощью детергентов. Клетки промывают несколько раз буферным солевым раствором и добавляют детергент (тритон Х-100), инкубируют на льду.

Лизис клеток с применением ферментов. Добавляют буферный раствор и фермент к небольшой биомассе и таким образом получают сферопласты и пропопласты.

Лизис осмотическим шоком. Используют высокую концентрацию солей или углеводов. Далее разводят дистиллированной водой в 10-50 раз. Используют для микроорганизмов с тонкой клеточной стенкой или при ее отсутствии.

Лизис с помощью замораживания-оттаивания. Замораживают с жидким азотом, оттаивают в теплой воде. Позволяет обрабатывать большое количество биомассы.

Гомогенизация — для микроорганизмов с тонкой клеточной стенкой, не имеющих клеточной стенки, для растительных и животных клеток.

Делается суспензия клеток в буферном растворе. Контролируют степень разрушения в фазово-контрастном микроскопе или по белку, освобожденному из клеток.

Х - пресс. Используют замороженные клетки в буферном растворе при -70 С. Затем продавливают через тонкую фильеру с помощью гидравлической системы. Клетки разрушаются от перепадов давления от атмосферного до высокого.

Растирание клеток с абразивами. В качестве абразивов используется кварцевый песок, толченое кварцевое стекло, пудру окиси алюминия. Также используется растирание замороженных клеток в жидком азоте, где абразивом выступают кристаллы льда. После растирания к полученной массе добавляют равный объем буферного раствора и центрифугируют для удаления абразивов, не разрушенных клеток и их обломков.

Вывод: в ходе выполнения лабораторной работы я ознакомился с методами механического разрушения клеток, также провёл опыты по разрушению клеток разными способами.

Лабораторная работа 4.