Опишите основные этапы молекулярного клонирования

Укажите основные биологические системы, использующиеся в молекулярной биотехнологии.

Характер биологической системы (микроорганизмы, клеточные линии насекомых, растений и млекопитающих, многоклеточные организмы) исключительно важен для биотехнологического процесса. Во многих случаях именно генетически модифицированная самовоспроизводящаяся биологическая единица (микроорганизм, вирус, растение или животное) является конечным коммерческим продуктом.

Прокариоты и эукариоты. Все живые организмы принято делить на две основные группы; прокариоты и эукариоты.

В книге в начале пишется про различия про- и эукариот, схема строения клетки, еще пишут про разнообразие м/о и темп режим тип термофилы мезофилы и психрофилы и т.д. и т.п. ДА…

Среди множества биологических объектов, использующихся в молекулярной биотехнологии, основными «рабочими лошадками» являются бактерии Escherichia coli, одноклеточные дрожжи Saccharomytes cerevisiae и различные клеточные линии животного происхождения. Все они играют важную роль в получении белков, кодируемых клонированными генами.

Escherichia coli — грамотрицательная непатогенная подвижная палочка длиной менее 1 мкм. Традиционная среда ее обитания – кишечник человека, может также высеваться ил почвы и воды. Штаммы Escherichia coli культивируются на обогащенных жидких питательных средах, содержащих аминокислоты, витамины, соли, микроэлементы и источник углерода. Е. coli можно культивировать в аэробных и анаэробных условиях, но для оптимальной продукции рекомбинантных белков Е. coli и другие микроорганизмы обычно выращивают в аэробных условиях. Рост клеточной массы и продукция белка лимитируются содержанием в питательной среде растворённого кислорода, для этого в ферментерах создают условия аэрации.

Кроме Е. coli в молекулярной биотехнологии используют множество других микроорганизмов, которые подразделяют на две группы:

1. Микроорганизмы как источники специфических генов (например, ген, кодирующий стабильную ДНК-полимеразу, которая используется в широко применяемой полимеразной цепной реакции – ПЦР; этот ген был выделен из термофильных: бактерий и клонирован в Е. coli).

2. Микроорганизмы, созданные генно-инженерными методами для решения определенных задач (например, различные штаммы Corynebacterium glutamicum, генетически модифицированные с целью повышения продукции промышленно важных аминокислот).

Saccharomytes cerevisiae – непатогенные одноклеточные организмы с диаметром клетки около 5 мкм, во многих отношениях представляют эукариотический аналог Е. coli. S cerevisiae размножаются почкованием, их способность к превращению сахара в этанол и углекислый газ издавна использовалась для изготовления напитков и хлеба. Клетки дрожжей делятся каждые 1,5-2 ч. S. cerevisiae является удобной моделью для исследования других эукариот, в том числе человека, так как многие гены, ответственные, за регуляцию клеточного деления S. cerevisiae сходны с таковыми у человека. Это способствовало идентификации и характеристике генов человека, отвечающих за развитие новообразований. Генетическая система дрожжей является непременным участником всех исследований по изучению ДНК человека.

Синтезированный бактериальной клеткой эукариотический белок часто: подвергают ферментативной модификации, присоединяя к белковой молекуле низкомолекулярные соединения, что необходимо для правильного функционирования белка. Однако Е. coli и другие прокариоты не способны осуществлять эту модификацию, поэтому для получения полноценных эукариотических белков используют S. cerevisiae и другие виды дрожжей.

В качестве биологических систем в молекулярной биотехнологии используют культуру эукариотических клеток. Кусочек ткани определенного организма (насекомого, растения, млекопитающего) обрабатывают протеолитическими ферментами (трипсином), расщепляющими белки межклеточного материала, при работе с растительными клетками используют ферменты, разрушающие клеточную стенку. Высвободившиеся клетки помещают в питательную среду, содержащую аминокислоты, антибиотики, витамины, соли, глюкозу, факторы роста. В этих условиях (деление клеток млекопитающих происходит примерно раз в сутки) на стенке емкости с культурой образуется клеточный монослой. Если после этого не перенести клетки в емкости со свежей питательной средой, рост прекращается. Обычно удается переносить и поддерживать до 50-100 клеточных генераций исходной (первичной) клеточкой культуры, затем клетки начинают терять способность к делению и гибнут.

В молекулярной биотехнологии устойчивые линии используют для крупномасштабного производства вакцин и рекомбинантных белков, для размножения вирусов и выявления белков, которые кодируются клонированными последовательностями ДНК.

3. Объясните суть технологии рекомбинантных ДНК. См ответ на 4 вопрос! Одно и тоже!

Опишите основные этапы молекулярного клонирования.

Технология рекомбинантных ДНК (ее называют также молекулярным клонированием или генной инженерией) — это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала (дезоксирибонуклеиновой кислоты, ДНК) из одного организма в другой.

Никакого единого, универсального набора методик здесь не существует, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме:

- Из организма — донора нужных генов — экстрагируют нативную ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК), подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция «клонирующий вектор—встроенная ДНК»).

- Эту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией.

- Идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки).

- Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

Для начала пишите немного про рестриктазы! См ответ на 5 вопрос!

Для осуществления молекулярного клонирования недостаточно одних только ферментов рестрикции:

Во первых, водородные связи между теми четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, недостаточно прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК. Необходим какой-то инструмент для устранения разрыва в сахарофосфатном остове молекулы, т. е. для восстановления связи между 3'-гидроксильной концевой группой одной цепи и 5'-фосфатной группой другой. Таким инструментом является ДНК-лигаза бактериофага Т4. Этот фермент катализирует образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые уже удерживаются вместе благодаря спариванию липких концов. Кроме того, ДНК-лигаза Т4 «сшивает» тупые концы.

Во-вторых, объединение разных молекул ДНК само по себе бесполезно, если вновь образованные комбинации (рекомбинантные ДНК) не будут реплицироваться в клетке-хозяине. Таким образом, если одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, то другая должна содержать информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК. Чтобы решить эту проблему, используют клонирующие векторы. Короче нужно встроить (клонировать!)

Далее пишите про векторы (в частности, плазмиды!) См ответ на 6 вопрос!