Опишите основные принципы методологии генной инженерии растений; охарактеризуйте бактерию Agrobacterium tumefaciens как природную генноинженерную систему

Одной из основных задач селекционеров было получение высокоурожайных сортов растений с повышенной пищевой ценностью. Наибольшее внимание уделялось при этом таким зерновым культурам, как кукуруза, пшеница и рис, однако были осуществлены программы и по скрещиванию других сельскохозяйственных и садовых культур. В качестве важного инструмента прямого генетического воздействия на растения применяется технология рекомбинантных ДНК, широко использующаяся в микробиологических системах. Одним из достоинств растительных клеток является их тотипотентность: из одной клетки может быть регенерировано целое растение, так что из клеток, сконструированных генноинженерными методами, можно получить фертильные растения, все клетки которых несут чужеродные гены (трансгенные растения). Если такое растение цветет и дает жизнеспособные семена, то желаемый признак передается последующим поколениям. Можно привести три основных аргумента в пользу получения трансгенных растений:

1. Во-первых, введение гена (генов) часто приводит к повышению сельскохозяйственной ценности и декоративных качеств культурных растений.

2. Во-вторых, трансгенные растения могут служить живыми биореакторами при малозатратном производстве экономически важных белков или метаболитов.

3. В-третьих, генетическая трансформация растений (трансгеноз) позволяет изучать действие генов в ходе развития растения и других биологических процессов.

Некоторые генетически обусловленные признаки — такие как инсектицидная активность, устойчивость к вирусным заболеваниям и гербицидам, замедление старения, устойчивость к неблагоприятным условиям окружающей среды, измененная окраска цветков, повышенная пищевая ценность семян и самонесовместимость — могут быть приобретены растением при введении в него одного или нескольких генов. На сегодняшний день уже получены многочисленные трансгенные растения на основе как культурных, так и диких видов. Биотехнология несомненно внесет коррективы в традиционные программы разведения растений, в рамках которых для выведения нового сорта требуется от 10 до 15 лет. А в будущем с ее помощью можно будет создавать растения с совершенно новыми характеристиками.

Трансформация растений Ti-плазмидой из Agrobacterium tumefaciens

Грамотрицательная почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens — фитопатоген, который в процессе своего жизненного цикла трансформирует клетки растений Эта трансформация приводит к образованию корончатого галла — опухоли, нарушающей нормальный рост растения. Этой болезни, имеющей серьезные агрономические последствия, подвержены только двудольные растения, в частности виноград, косточковые фруктовые деревья, розы. Образование корончатого галла начинается с проникновения, интеграции в геном растительных клеток и экспрессии специфического сегмента бактериальной плазмидной ДНК — так называемой Т-ДНК (от англ. transferred DNA). Т-ДНК — это часть плазмиды, индуцирующей развитие опухоли (tumor-inducing plasmid, Ti-плазмиды); ее несут большинство штаммов A. tumefaciens.

Длина Т-ДНК варьирует от 12 до 24 т. п. н. в зависимости от штамма. Штаммы A. tumefaciens, не содержащие Ti-плазмиды, не способны индуцировать развитие корончатого галла. Инфекционный процесс начинается с прикрепления A. tumefaciens к клеткам растения в месте повреждения, часто у основания стебля (у корневой шейки). Ранее предполагалось, что A. tumefaciens заражает именно поврежденные растения вследствие разрушения клеточной стенки и устранения физического барьера, затрудняющего проникновение бактерий в клетку. Однако сейчас считается, что все дело в специфических фенольных соединениях, ацетосирингоне и гидроксиацетосирингоне, которые выделяет поврежденное растение. Ацетосирингон и гидроксиацетосирингон активируют гены вирулентности (vir), которые локализованы в участке Ti-плазмиды длиной 35 т. п. н., находящемся за пределами Т-ДНК. Продукты vir-генов необходимы для транспорта и интеграции Т-ДНК в геном растительной клетки. Существуют по меньшей мере семь разных virгенов.

После присоединения A. tumefaciens, несущей Ti-плазмиду, к растительной клетке и активации вир-генов Т-ДНК транспортируется в клетку, по-видимому, с помощью механизма, аналогичного механизму переноса плазмидной ДНК из донорной клетки в реципиентную в процессе конъюгации. При этом Т-ДНК находится в одноцепочечной форме, и именно в такой форме она встраивается в хромосомную ДНК растения. Переход Т-ДНК в одноцепочечную форму начинается с внесения в нее разрывов по обеим фланкирующим ее последовательностям. При этом правая фланкирующая последовательность оказывается на 5'-конце одноцепочечной ТДНК, а левая — на 3'-конце. Предполагается, что интеграция Т-ДНК в геном растения зависит от специфических последовательностей, локализованных в правой фланкирующей последовательности, которая содержит повтор длиной 25 п. н. Аналогичный повтор присутствует и в левой последовательности, однако, как показывает делеционный мутагенез, она не принимает участия в интеграции. Большинство генов Т-ДНК активируются только после ее встраивания в геном растения. Их продукты и вызывают образование корончатого галла. Гены iaaMiA iaaH, известные также как tmsl и tms2 соответственно, кодируют ферменты, принимающие участие в синтезе растительного гормона ауксина (индолилуксусной кислоты). Ген iaaM кодирует фермент триптофан-2-монооксигеназу, которая катализирует превращение триптофана в индолил-3-ацетамид, а ген iaaH — фермент индолил-3-ацетамидгидролазу, катализирующую образование индолилуксусной кислоты из индолил3-ацетамида. Кроме того, Т-ДНК несет ген tmr (известный также как ген itp), кодирующий изопентилтрансферазу — фермент, который катализирует присоединение к 5'-AMP изопреноидной боковой цепи с образованием цитокининов изопентениладенина и изопентениладенозинмонофосфата. При гидроксилировании этих соединений растительными ферментами образуются цитокинины трансзеатин и трансрибозилзеатин соответственно. И ауксин, и цитокинины регулируют рост и развитие растительной клетки, но, присутствуя в избытке, могут вызывать у растений образование опухолей, таких как корончатый галл.

Кроме генов ауксина и цитокинина, Т-ДНК каждой специфической Ti-плазмиды содержит ген, детерминирующий синтез соединения из класса опинов. Опины — это уникальные продукты конденсации амино- и кетокислот или аминокислот и Сахаров. Например, при конденсации аргинина и пировиноградной кислоты образуется октопин, аргинина и а-кетоглутаральдегида — нопалин, а бициклического производного глутаминовой кислоты и сахара — агропин. Опины синтезируются в корончатом галле, а затем секретируются. Они могут использоваться как источник углерода (а иногда и как источник азота) любой A. tumefaciens, которая несет в Ti-плазмиде ген(ы) катаболизма соответствующего опина, локализованные вне Т-ДНК. Большинство других исследованных почвенных микроорганиз мов не способны использовать опины как источник углерода. Таким образом, в процессе эволюции выработался уникальный набор механизмов, посредством которых каждый штамм A. tumefaciens генетически трансформирует растительные клетки в «биологические фабрики» по производству соединений углерода, использовать которые могут только сами эти бактерии.