2020-01-14
219
Секвенирование нового поколения (англ. next generation sequencing, NGS) — техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания её первичной структуры. Технология методов секвенирования нового поколения (СНП) позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участков генома, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. СНП осуществляется с помощью повторяющихся циклов удлинения цепи, индуцированного полимеразой, или многократного лигирования олигонуклеотидов. В ходе СНП могут генерироваться до сотен мегабаз и гигабаз нуклеотидных последовательностей за один рабочий цикл.
Первая эффективно используемая на коммерческой основе платформа СНП. Компания 454 Life Sciences. Данная технология представляет собой последовательный синтез методов эмульсионного ПЦР и пиросеквенирования. Амплификация ДНК проходит в каплях воды в масляной эмульсии. В каждой капле воды находится одноцепочечная матрица ДНК, связанная с праймером на бусинке. Далее, каждая бусина помещается на чип, представляющий собой оптическое волокно. Туда же помещаются необходимые для секвенирования ферменты: ДНК-полимераза, люцифераза, АТФ-сульфурилаза. В последней сборке реакция секвенирования идет в ячейках объемом 3,4·106 пкл, на стенках которых есть специальное металлическое покрытие, нивелирующее шум. Длина одного прочтения, пар оснований – 400, стоимость секвенирования 1 млн пар оснований -10$, стоимость секвенатора - 500 000$, время работы за цикл - 7 часов, количество прочтений за цикл - 1 000 000, преимущества - длина прочтённых геномных участков, скорость; недостатки - стоимость; погрешность.
Illumina/Solexa method Авторы метода — британские химики Шанкар Баласубраманиан и Дэвид Кленерман. Этот метод секвенирования использует прикреплённые к микросферам единичные молекулы ДНК. В 2006 году была запущена Solexa Genome Analyzer 1G, первая платформа, генерирующая короткие участки генома. После её приобретения компанией Illumina Genome Analyzer использует оптически прозрачные ячейки с 8 индивидуальными поверхностями, где связываются олигонуклеотиды. В отличие от пиросеквенирования удлинение последовательности происходит постепенно, что позволяет за раз с помощью камеры снимать большие ДНК-чипы. Длина одного прочтения, пар оснований – 300, стоимость секвенирования 1 млн пар оснований -0,05-0,15 $, стоимость секвенатора - 600 000$, время работы за цикл - 9 дней, количество прочтений за цикл - до 3 000 000, преимущества - эффективность, стоимость; недостатки – скорость.
SOLiD. Платформа SOLiD (Supported Oligonucleotide Ligation and Detection System 2.0), разработанная Applied Biosystems — технология секвенирования коротких чтений, основанная на лигировании. Метод был предложен в лаборатории Георга Черча и опубликован в 2005 году (был заново просеквенирован геном Escherichia coli). По технологии SOLiD при секвенировании фрагменты ДНК лигируются на олигонуклеотидные адаптеры, прикрепленные к шарикам, далее они амплифицируются с помощью эмульсионной ПЦР.. Длина одного прочтения, пар оснований – 35-50, стоимость секвенирования 1 млн пар оснований – 0,13$, стоимость секвенатора - 595 000$, время работы за цикл - 9 дней, количество прочтений за цикл - до 1 300 000 000, преимущества - стоимость; недостатки –скорость.
Helicos Biosciences Первый метод секвенирования единичных молекул, разработанный HeliScope (Helicos BioSciences) имеет производительность около 1Gb/день. Принцип работы: после клональной амплификации образца происходит фрагментация ДНК с последующим полиаденилированием на 3'-конце с дальнейшим секвенированием, чередующимся с промыванием образцов нуклеотидами с флуоресцентной меткой. Длина одного прочтения, пар оснований – 2900, стоимость секвенирования 1 млн пар оснований - 2$, время работы за цикл - 1 часа, количество прочтений за цикл - 35000-75000, преимущества - Длина прочтённых геномных участков; скорость; недостатки – низкая производительность при желаемой малой погрешности; стоимость.
Ion semiconductor sequencing Метод основан на связи между химической и цифровой информацией, что позволяет быстрее и проще секвенировать большое количество образцов. Эта технология также называется рН-индуцированным секвенированием. Процесс основан на детекции протонов, которые получаются при синтезе цепи ДНК как побочный продукт. Как следствие, рН раствора меняется, что и можно детектировать. Платформа Ion Torrent отличается от остальных технологий секвенирования тем, что в ней не используются модифицированные нуклеотиды и оптические методы. Метод Ion Torrent позволяет исследовать транскриптомы, малые РНК, проводить ChIP-seq. Более того, с его помощью можно изучать геномы микробных сообществ. Длина одного прочтения, пар оснований – 600, стоимость секвенирования 1 млн пар оснований - 1$, стоимость секвенатора - 50 000$, время работы за цикл - 1,5 часа, количество прочтений за цикл - до 5 000 000, преимущества - скорость, стоимость; недостатки – погрешность.
Секвени́рование РНК (RNA-seq) — метод определения первичной структуры молекул РНК, представляющий собой высокочувствительный и точный инструмент для изучения траскриптома. Под этим может подразумеваться как секвенирование мРНК, так и определение последовательности некодирующих РНК. Современное полногеномное секвенирование основано на прямом секвенировании фрагментов кДНК. В отличие от другого широкомасштабного метода анализа транскриптома — экспрессионных микрочипов, РНК-секвенирование позволяет получать данные об аллель-специфичной экспрессии генов, сплайсинговых вариантах транскриптов, пост- и ко-трансляционном редактировании РНК, однонуклеотидных полиморфизмах, а также химерных генах. Кроме того, РНК-секвенирование позволяет получить абсолютную количественную информацию о представленности различных транскриптов в пробе, в отличие от относительных количественных данных микрочипов. Совершенствование технологий секвенирования РНК наряду с развитием секвенирования РНК одиночных клеток (single-cell RNA-seq) позволяет более детально изучать этиологию и патогенез различных заболеваний
Определение профиля экспрессии генов Метод секвенирования РНК становится основным методом определения того, какие гены и на каком уровне экспрессируются в клетке. С помощью РНК секвенирования можно определять различия в экспрессии генов на различных стадиях развития организма или в разных тканях. Например, разработан метод локализации in situ последовательностей РНК-транскриптов с помощью флуоресцентного секвенирования, который позволяет изучать фенотип клеток и регуляцию активности генов непосредственно в биологическом образце (на срезах тканей) . Также можно определить, транскрипция каких генов изменяется при развитии болезней и рака. В связи с удешевлением методов секвенирования нового поколения появилась возможность определять экспрессию генов у любого человека для диагностики заболеваний. Наряду с секвенированием РНК для измерения профиля экспрессии генов также широко используется кэп-анализ экспрессии генов.
Определение мест альтернативного сплайсинга и выявление однонуклеотидных полиморфизмов Секвенирование РНК — наиболее удобный способ определения мест альтернативного сплайсинга, а также количественного соотношения различных альтернативных форм транскрипта. Другие методы не позволяют картировать места альтернативного сплайсинга на всем протяжении генома. Также как и определение экспрессии генов, определение соотношения альтернативных форм транскриптов можно проводить на различных стадиях развития организма или в разных тканях. РНК-секвенирование позволяет различить транскрипты с отличием в одном нуклеотиде, поэтому может быть использовано как для выявления экспрессируемых однонуклеотидных полиморфизмов в генах, так и для изучения процесса редактирования РНК.
Изучение редактирования РНК Основным методом выявления внесённых изменений является сравнение последовательности нуклеотидов геномной ДНК и соответствующих участков РНК. Важным прогностическим признаком обнаружения сайтов редактирования РНК является наличие эволюционно консервативных нуклеотидных последовательностей в окружении места редактирования.
РНК-секвенирование раковых транскриптомов. РНК-секвенирование широко используется в настоящее время для исследование особенностей транскриптома раковых клеток, в том числе появление химерных транскриптов и продуктов альтернативного сплайсинга, специфичных для раковых клеток.
Детекция гибридных генов Гибридизация генов происходит из-за различных структурных модификаций в геноме и может быть связана с раком. Возможность анализировать весь транскриптом образца с помощью секвенирования РНК делает этот метод привлекательным для поиска подобных частых преобразований при раковой трансформации клеток
