2020-01-14
82
ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза была впервые описана в растворимой фракции серого вещества головного мозга котов [22]. Поскольку фермент полностью ингибируется ФМСФ, он был назван ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазой [22].
ФМСФ-ингибируемая КП найдена во всех отделах мозга и практически во всех тканях и органах крыс. Наибольшая активность фермента отмечена в надпочечниках, яичниках, семенниках, гипофизе, обонятельных луковицах [9]. В гипофизе активность была в 1,6 раза меньше, а в семенниках – в 2,5 раза меньше, чем в надпочечниках [53, 54]. В порядке снижения активности фермента отделы головного мозга можно расположить следующим образом: гипофиз, обонятельные луковицы, большие полушария, гипоталамус, стриатум, мозжечок, гиппокамп, четверохолмие [16, 23, 53, 54]. В отделах мозга, богатых телами нейронов, активность фермента выше, чем в проводящих путях [16, 23].
ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза имеет Mr 100000 – 110000, проявляет максимальную активность при рН 6,0 – 6,5 [22, 26, 27]. При нейтральных и слабощелочных значениях pH фермент инактивируется, но стабилизируется NaCl [26, 27]. ФМСФ-ингибируемая КП, по-видимому, не является металлозависимой карбоксипептидазой, т.к. не ингибируется ЭДТА и ГЭМЯК [9, 19]. Активность фермента полностью подавляется ингибитором сериновых протеиназ – ФМСФ и реагентом на сульфгидрильные группы – ПХМБ. Иодацетамид снижает активность действия фермента примерно в 2 раза. ЭДТА, 2-меркаптоэтанол, N-этилмалеимид, ионы Со2+ не изменяют активность ФМСФ-ингибируемой КП [22, 25, 26].
ФМСФ-ингибируемая КП представлена в мозге как в растворимой форме, так и в комплексе с мембранами субклеточных структур [9]. Согласно данным тонкослойной хроматографии фермент отщепляет аргинин от Leu5-энкефалин-Arg6 и дансил-Phe-Leu-Arg, причем сродство фермента к дансил-Phe-Leu-Arg в несколько раз выше, чем к дансил-Phe-Ala-Arg (Кm для гидролиза дансил-Phe-Leu-Arg 48 мкМ, дансил-Phe-Ala-Arg – 96 мкМ) [22, 25, 26].
Тканевое и региональное распределение ФМСФ-ингибируемой КП коррелирует с распределением нейропептидов и секретируемых белков [9, 33, 201]. Вместе с тем следует отметить, что в отделах головного мозга распределение активности фермента несколько не совпадает с распределением биологически активных пептидов в целом [201]. Наиболее высокая активность ФМСФ-КП обнаружена в эндокринных тканях, синтезирующих стероидные гормоны: яичниках, надпочечниках, семенниках [54]. В надпочечниках, где синтезируется большое число энкефалинов, активность ФМСФ-КП в 8 – 9 раз выше, чем активность КП Н. Кроме того, сродство ФМСФ-КП к дансил-Phe-Leu-Arg значительно выше, чем сродство КП Н [9]. Это позволяет предположить, что ФМСФ-ингибируемая КП как и КП Н участвует в процессинге нейропептидов, и вероятно, наиболее предпочтительным эндогенным субстратом для ФМСФ-ингибируемой КП является проэнкефалин (энкефалин- Leu5-Arg6).
Обнаружено, что ФМСФ-КП вовлекается в развитие алкогольной зависимости [17], в ответ на различные стрессирующие воздействия [5], поэтому представляет интерес изучение активности этого фермента при модуляции ГАМК- и дофаминергических систем.
Таким образом, данные препараты изменяют деятельность пептидергических систем. Введение психолептиков приводит к изменению уровня регуляторных пептидов в тканях. Для понимания динамики процессов, происходящих в пептидергической системе при введении психолептиков, необходима информация о процессах синтеза и деградации регуляторных пептидов [11, 21]. Карбоксипептидазы участвуют в конечных стадиях обмена пептидов [21, 30]. Поэтому изучение активности КП Н, ФМСФ-КП и КП М при введении галоперидола и диазепама представляет значительный интерес, как для уточнения биологической роли самих ферментов, так и для понимания механизмов функционирования пептидергических систем мозга.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы исследования
Опыты проводили на самцах лабораторных белых беспородных крыс массой 200-250 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария.
При изучении острого влияния психолептиков на активность КП Н, КП М и ФМСФ-КП in vivo диазепам вводили внутрибрюшинно в физрастворе в дозе 5 мг/кг веса, галоперидол – 2 мг/кг веса. Контрольные животные получали равное количество физраствора. Крыс декапитировали под наркозом через 0,5, 4, 24 и 72 часа после введения препаратов. При изучении хронического влияния психолептиков вышеуказанные дозы препаратов вводились в течение 10 дней. Через 1 и 3 суток после воздействия животных декапитировали. Для исследования влияния препаратов на КП Н, КП М и ФМСФ-КП in vitro гомогенаты тканей инкубировали с психолептиками в течение 60 мин при 4ºС. Концентрации препаратов соответствовали дозам при введении in vivo.
После декапитации извлекали гипофиз, гипоталамус, четверохолмие, мозжечок, стриатум, гиппокамп, большие полушария, надпочечники и семенники. Ткани очищали от оболочек и кровеносных сосудов, высушивали фильтровальной бумагой.
Для определения активности основных карбоксипептидаз ткани взвешивали, а затем гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в 10 мМ натрий-ацетатном буфере (рН=5,6), содержащем 50 мМ NaCl в соотношении 1:100 (вес:объем).
В качестве специфических ингибиторов применяли ФМСФ (”Serva”, США) и ГЭМЯК (Serva”, США). В качестве субстратов использовали дансил-фен-ала-арг и дансил-фен-лей-арг (синтезированы к.х.н. Калихевичем В.Н.). В работе использовали трис-HCl (“Serva”, США) и ацетат натрия (“Merck”, Германия), все остальные реактивы были отечественного производства с квалификацией ”ХЧ” и ”ОСЧ”.
Схема эксперимента
Методы исследования
