Протеолитические ферменты обмена регуляторных пептидов при действии психолептиков

Биологические свойства регуляторных пептидов, изменение их уровня под влиянием различных воздействий в определенной степени обусловлены особенностями функционирования ферментативных систем обмена биологически активных пептидов. Изменение интенсивности процессов синтеза и деградации при изменении функционирования медиаторных систем [65, 83, 95, 193, 225, 238] свидетельствует о регуляторной функции протеолиза, которая состоит в запуске и прерывании ряда биохимических и физиологических процессов. Биологически активные пептиды, в свою очередь, могут определять физиологические эффекты лекарственных препаратов, вовлекаться в развитие зависимости от них. Поэтому очень важным представляется исследование активности ферментов обмена нейропептидов при остром и хроническом введении галоперидола и диазепама.

При хроническом потреблении диазепама наблюдалась тенденция к снижению активности ангиотензинпревращающего фермента и повышению активности карбоксипептидазы Н в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме крыс [20]. Вместе с тем, введение в течение 10 дней диазепама сопровождается повышением содержания в мозге эндозепинов [8], что может указывать на усиление их биосинтеза и ослабление распада. Авторы [20] предполагают, что исследуемые ферменты вовлекаются в обмен этих пептидов.

При совместном воздействии стресса и диазепама изменения активности карбоксипептидазы Н во всех отделах были меньшими, чем при их раздельном воздействии. Введение диазепама при эмоциональном стрессе привело к снижению активности ангиотензинпревращающего фермента по сравнению с животными, подвергавшимися воздействию только диазепама или только стресса [20].

Таким образом, если при приеме диазепама в сочетании с эмоциональным стрессом наблюдалась тенденция к компенсации изменений активности КП Н, то снижение активности ангиотензинпревращающего фермента было более выраженным. Известно, что карбоксипептидаза Н участвует в биосинтезе АКТГ [128, 304], секреция которого при стрессе возрастает. Введение бензодиазепиновых транквилизаторов, в частности, феназепама уменьшает концентрацию АКТГ [51, 111, 316, 330] при стрессе. Активность карбоксипептидазы Н в случае введения диазепама при стрессе снижается по сравнению с таковой только при стрессе. Вместе с тем, ангиотензинпревращающий фермент участвует, по-видимому, в деградации энкефалинов, вещества Р и пептида дельта-сна [182], которые способствуют адаптации к стрессу [48]. Снижение активности ангиотензинпревращающего фермента могло бы, вероятно, способствовать повышению их содержания. Возможно, что диазепам оказывает антистрессорное воздействие на организм путём модуляции активности карбоксипептидазы Н и ангиотензин-превращающего фермента, что, в свою очередь, может приводить к уменьшению содержания АКТГ, и увеличению содержания пептидов, способствующих адаптации.

Степень эмоциональности животных влияла на активность ангиотензинпревращающего фермента в мозге крыс. Наиболее выраженные изменения наблюдались у низкоэмоциональных животных [20]. Также влиял диазепам и на активность ангиотензинпревращающего фермента в сыворотке крови. Однако введение диазепама на фоне стресса привело к наиболее значимому понижению активности фермента в мозге у высокоэмоциональных, а в сыворотке – у низкоэмоциональных животных [20].

Потребление диазепама в течение 10 дней вызывало снижение активности ангиотензинпревращающего фермента в мозге крыс. Наиболее выраженное снижение активности наблюдалось в гипофизе (на 63%) [13]. В гипоталамусе и стриатуме снижение активности фермента было менее выраженным (на 20 и 23% соответственно). Авторы [13] предполагают, что ангиотензинпревращающий фермент играет определенную роль в обмене опиоидных, стресс- и DBI-происходящих пептидов.

При одновременном потреблении крысами этанола и диазепама наблюдалось повышение активности ангиотензинпревращающего фермента по сравнению с активностью при раздельном потреблении этих веществ в гипофизе и гипоталамусе [13]. По мнению авторов, купирование диазепамом алкогольного абстинентного синдрома может быть обусловлено тем, что при совместном воздействии эти вещества вызывают менее выраженное снижение активности ангиотензинпревращающего фермента, чем при раздельном. Сходство поведенческих и физиологических эффектов этанола и диазепама возможно объясняется их сходным влиянием на активность ангиотензинпревращающего фермента.

Введение галоперидола (1 мг/кг) в течение 7 дней привело к уменьшению активности аминопептидазы N в стриатуме и коре больших полушарий, что, в свою очередь, вызвало уменьшение накопления фрагментов (тирозин и гли-гли-фен-мет), образующихся при действии фермента на мет-энкефалин [199].

Тир-гли-гли – производное энкефалина, полученное при действии энкефалиназы. Острое воздействие агонистов Д₂-рецепторов вызвало повышение содержания трипептида в стриатуме крыс. Этот эффект был блокирован галоперидолом, в то время как, просто инъекция галоперидола не изменила уровень тир-гли-гли. Однако хроническое потребление нейролептика привело к увеличению содержания фрагмента энкефалина в стриатуме, возможно, путем активации энкефалиназы [199, 213].

Нейтральная эндопептидаза 24.11, как известно, использует в качестве субстратов ряд нейропептидов, включая энкефалины и нейротензин. Хроническая обработка галоперидолом (1 мг/кг/день, 12 дней) увеличила активность фермента в аккумбентном ядре. Более высокие дозировки практически не повлияли на активность нейтральной эндопептидазы 24.11. активность фермента в гипоталамусе не изменилась при введении галоперидола [198].

Острое воздействие галоперидола привело к повышению уровня каталитической единицы цАМФ-зависимой киназы в стриатуме [321].

Grigoriants и соавт. обнаружили увеличение уровня мРНК КП Н при введении его в течение 14 и 21 дня в дозе 2 мг/кг в промежуточной и задней долях гипофиза на 90 – 110% [158]. Введение бромокриптина в течение 1 – 5 дней привело к снижению уровня мРНК прогормонконвертазы 2, КП Н и пептидилглицин-α-амидирующей монооксигеназы в промежуточной доле гипофиза, потребление галоперидола вызвало обратный эффект [253].

Уровень мРНК аминопептидазы N, нейтральной эндопептидазы 24.11 и прогормонконвертаз 1 и 2 в хвостатом ядре и фронтальной коре мозга крысы не изменился после 7-дневного потребления галоперидола (1 мг/кг). Авторы предполагают, что возможно большую роль в модуляции деятельности пептидаз играет трансляция мРНК или встраивание белка в мембрану [329].

Каликреиноподобный фермент относится к семейству аргининовых эндопептидаз. В опытах in vivo введение бромокриптина и галоперидола вызвало соответственно уменьшение и увеличение уровня мРНК фермента в промежуточной, но не в передней доле гипофиза самцов крыс [266, 268].

Таким образом, психолептики вызывают изменение активности ряда протеолитических ферментов. Это, в свою очередь, ведет к изменению уровня многих регуляторных пептидов, обеспечивающих основные и побочные эффекты препаратов.

 

Карбоксипептидаза Н

Карбоксипептидаза Н (КП Н, энкефалинконвертаза, карбоксипепти-даза Е, КФ 3.4.17.10) впервые была выделена и охарактеризована в 1982 г. Fricker L.D. и Snyder S.H. из хромаффинных гранул надпочечников [147].

КП Н широко представлена в тканях человека, быка, крысы, мыши, акулы, шпорцевой лягушки, ската-удильщика, моллюска Aplysia [143, 149, 280, 297, 311] и обладает сходным региональным распространением, физико-химическими и каталитическими свойствами.

Высокая активность КП Н была обнаружена в гормонпродуцирующих клетках гипофиза [128, 145, 181, 190, 197], a- и b-клетках поджелудочной железы [111, 119, 157], хромафинных клетках надпочечников [147, 148, 149, 175, 311], более низкая – в пептидергических нейронах гипоталамуса, стриатума, гиппокампа, среднего мозга, больших полушарий и мозжечка [15, 148, 149, 308]. При этом в гипоталамусе высокая активность КП Н обнаружена в медиальном возвышении, супраоптическом, паравентрикулярном и супрахиазматическом ядрах [220]. В гиппокампе фермент обнаружен в пирамидальных клетках и во внутренней части молекулярного слоя зубчатой извилины. КП Н также обнаружена в центральных нейронах миндалины [219]. Имеются сведения о наличии активности КП Н в водянистой жидкости глаза человека [251], в плаценте [26]. Таким образом, тканевое распределение активности этой карбоксипептидазы в целом соответствует распределению нейропептидов [26].

В клетке КП Н локализована, в основном, в секреторных гранулах, в структурных элементах эндоплазматического ретикулума и комплекса Гольджи, содержащих биологически активные пептиды – АКТГ [128, 175], гормон роста [103], пролактин [103], инсулин [114], глюкагон [159], энкефалины [147, 148], вазопрессин [282], окситоцин [247], вещество Р [104], атриальный натрийуретический фактор [220].

Ген КП Н был клонирован и секвенирован [60, 225, 277]. Транскрипция КП Н осуществляется с единственного сайта транскрипции [245, 304]. мРНК КП Н состоит из 2100 нуклеотидов [137]. Полный ген охватывает приблизительно 50000 оснований и состоит из девяти экзонов, каждый из которых содержит кодирующие белок области [190].

Уровни мРНК КП Н и активности КП Н в мозге и тканях в целом коррелируют между собой [81]. Наивысшие уровни мРНК КП Н обнаружены в пирамидальных клетках гиппокампа, в передней и промежуточной долях гипофиза, эпендимных клетках боковых желудочков мозга, базолатеральной миндалине, супраоптическом и паравентрикулярном ядрах. Средние уровни мРНК КП Н у крыс обнаружены в таламусе, медиальном коленчатом ядре, коре мозжечка и промежуточной оливе. Наименьшие уровни выявлены в гранулярном клеточном слое гиппокампа, латеральном гипоталамусе, бледном шаре и в ретикулярной формации ножки мозга [221]. Высокая экспрессия мРНК КП Н отмечена в паравентрикулярном и супраоптическом ядрах гипоталамуса – местах преимущественного синтеза окситоцина и вазопрессина [86]. мРНК КП Н и ферментативная активность обнаружена также в клонах эндокринных клеток – AtT-20, GH-3, GH4C1 и неэндокринных – L, 3T3, SK-HEP-1, HEK293, COS, C127 [124, 188], а также в культуре астроцитов [198].

КП Н является гликопротеином и состоит из одной полипептидной цепи [15, 114, 140, 220, 245]. Фермент синтезируется в виде неактивного зимогена, состоящего из 476 аминокислотных остатков, с Mr 75000 [240, 277, 306], который превращается в активную форму под действием трипсиноподобных ферментов в ходе созревания секреторных везикул [134, 160]. Сначала образуется неактивная форма с Mr 65000 [176, 177], которая превращается в активные формы с Mr 52000 – 53000 и 55000 – 57000 [134, 160, 255]. Отличия в Mr этих форм не зависят от степени гликозилирования [134, 255, 257]. Форма с Mr 55000 – 57000 отличается от формы с Mr 52000 – 53000 наличием N-концевого сигнального пептида [255]. Обе формы существуют и в растворимом, и в связанном с мембранами виде [134, 160]. Имеются сведения о том, что мембранная форма КП Н (57000) связана с эндоплазматическим ретикулумом и элементами комплекса Гольджи, а растворимая форма КП Н (54000) – с секреторными гранулами [159]. За связывание фермента с мембранами отвечает C-концевая амфифильная последовательность, которая присутствует только у мембраносвязанной формы [140]. Она состоит из 21 остатка чередующихся гидрофобных и гидрофильных аминокислот. Активность растворимой формы фермента в расчёте на молекулу фермента выше, чем мембраносвязанной [136, 141]. Соотношение между растворимой и мембраносвязанной формами изменяется по мере созревания секреторных везикул [178]. Активность растворимой и мембраносвязанной форм КП Н в разных клетках и тканях различно. В частности, в клетках линий RIN 1046-38 и RIN 1046-44 75% зрелой КП Н обнаружено в мембраносвязанной форме [134]. С другой стороны, в передней и задней долях гипофиза 70% всей активности КП Н представлено растворимой формой [255].

Фермент проявляет максимальную активность при рН 5,6-6,0, что соответствует рН внутри секреторных гранул [137, 148, 149, 247]. КП Н сильно активируется ионами Со²⁺ (в 5 – 10 раз) и в меньшей степени – ионами Ni²⁺ (в 2 – 3 раза), полностью ингибируется ионами Cu²⁺, Cd²⁺ и ЭДТА. Ионы других двухвалентных металлов (Zn²⁺, Ca²⁺, Mg²⁺) не влияют на его активность [147, 148, 149]. Ионы Zn²⁺ полностью восстанавливают активность КП Н после ингибирования его действия 1 мМ раствором ЭДТА, при добавлении ионов Со²⁺ и Ni²⁺ активность фермента значительно повышалась, а Ca²⁺ и Mg²⁺ активность фермента не восстанавливали [15]. Ионы Ca²⁺ влияют на агрегацию и высвобождение белка из секреторных везикул [161, 242, 305]. Таким образом, карбоксипептидаза Н – это металлозависимый фермент, в активном центре которого находится ион Zn²⁺ [15]. Реагенты на сульфгидрильные группы HgCl₂ и N-этилмалеимид существенно ингибируют активность фермента [144]. 2-меркаптоэтанол, каптоприл и ФМСФ не оказывают заметного влияния на активность КП Н [15, 220]. Карбоксипептидаза Н содержит SH-группу(ы) и является тиолзависимым цинк-металлоферментом [15]. Активность КП Н ингибируется CuCl₂, HgCl₂, р-хлормеркурфенилсульфатом, АПМЯК, ЭДТА, 1,10-фенантролином и 2-меркаптометил-3-гуанидилэтилтиопропановой кислотой [123, 149, 175, 181]. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и ГПЯК с K_i 8,8 и 7,5, соответственно [114, 144, 280, 311]. Активность фермента существенно снижается при добавлении рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона, вещества Р, тиреотропин-рилизинг фактора, вазопрессина, окситоцина, Met- и Leu-энкефалина, АКТГ [180, 259, 282].

КП Н обладает, практически, абсолютной специфичностью по отношению к пептидным субстратам с С-концевыми основными аминокислотами [26, 27, 123, 326]. КП Н хорошо отщепляет остатки -Lys и -Arg от природных и синтетических субстратов. ¹²⁵I-Met-энкефалин-Arg⁶, ¹²⁵I-Met-энкефалин-Lys⁶ [19], АКТГ-Lys¹⁵-Lys¹⁶-Arg¹⁷, Arg⁸-вазопрессин-Gly-Lys-Arg являются природными субстратами исследуемого фермента [175, 181, 282]. Для определения активности КП Н разработано множество методов, наиболее часто используемым является флюорометрический метод Friker и Snyder с использованием таких субстратов как дансил-Phe-Ala-Arg и дансил-Phe-Leu-Аrg [144, 149, 311]. О-кумароил-Phe-Ala-Arg [45], даларгин [47], Leu⁵-энкефалин [47], [³Н]-бензоил-Phe-Leu-Arg, [³Н]-бензоил-Phe-Ala-Arg [278, 308], ¹²⁵I-acetyl-Tyr-Ala-Arg, гиппурил-Arg [143] и другие также были предложены в качестве субстратов для определения активности КП Н.

У мышей линии fat/fat единичная точечная мутация Ser202 на Pro в гене, кодирующем КП Н, приводит к нарушению созревания регуляторных пептидов: инсулина [186], холецистокинина [203], пронейротензина и промеланоцитстимулирующего гормона [102, 283], тириолибирина [246], проэнкефалина [139], а также изменяет деятельность опиоидных рецепторов [88, 139]. Кроме того, нарушается внутриклеточный транспорт гормонов гипофиза через конститутативный путь [246, 293]. Это приводит к многочисленным эндокринным нарушениям, включая гиперинсулинемию и бесплодие [110, 216, 307].

Следует отметить, что внешнее воздействие способно быстро изменять уровень мРНК КП Н. Увеличение концентрации мРНК КП Н в гипоталамусе наблюдается при увеличении содержания окситоцина и вазопрессина [86], в ганглионарных клетках сетчатки глаза уровень мРНК КП Н повышается сразу после смены условий освещенности [288].

В клетках GH4C1 (из переднего гипофиза крысы, продуцирующих пролактин) 50 мМ раствор KCl увеличивает секрецию КП Н и пролактина в 10 раз, а 100 мМ тиреотропин-рилизинг фактор – в 2 – 3 раза [145]. Кроме того, эстрадиол (1 нМ), инсулин (300 нМ) и фактор роста эпидермиса (10 нМ) увеличивают внутриклеточный уровень КП Н в 2 раза по сравнению с контролем. Km при этом не изменяется, но увеличивается V_max [145].

Rodriguez и соавт. обнаружили, что действие дексаметазона на клетки AtT-20 снижает уровень мРНК КП Н и ПОМК примерно на 30% [277]. С другой стороны, прибавление кортикотропин-рилизинг фактора к клеткам, которые подвергались воздействию дексаметазона, вызывает 2 – 3-х кратное увеличение уровня мРНК КП Н и ПОМК [277]. Авторы считают, что уровни мРНК ПОМК и КП Н согласованно регулируются кортикотропин-рилизинг фактором и стероидными гормонами. При действии кортикотропин-рилизинг фактора на клетки AtT-20, не подверженные действию дексаметазона, происходит возрастание активности КП Н [223].

При хроническом прибавлении дексаметазона, кортикостерона, кортикотропин-рилизинг фактора, соматостатина к клеткам линии AtT-20/D16v уровень мРНК КП Н и активность КП Н не изменяются [223, 318].

При внутрибрюшинном введении дексаметазон и гидрокортизон (в дозах 1 и 100 мг на кг массы тела, соответственно) снижают активность растворимой и мембраносвязанной формы КП Н в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме крыс, но динамика влияния во времени отличается [19]. В изученные интервалы (0,5, 4 и 24 часа после инъекции) дексаметазон сильнее подавляет активность в начальный период, тогда как действие гидрокортизона более выражено через 24 часа после введения. In vitro дексаметазон и гидрокортизон не оказывают влияния на активность КП Н [19]. Авторы [19] предполагают, что снижение активности КП Н in vivo происходит за счет снижения синтеза мРНК КП Н.

Субстратная специфичность, оптимум рН, клеточное и субклеточное распределение, совместная локализация фермента и биологически активных пептидов, свидетельствуют о вовлечении КП Н в процессинг многих нейропептидов, таких как окситоцин, вазопрессин, нейротензин, меланоцитстимулирующий гормон, вещество Р, энкефалины и др. [149, 175, 181, 259, 282, 283]. Показано, что КП Н вовлекается в определение агрессивности [30], устойчивости к стрессу [29], предрасположенности к потреблению этанола [31], в развитие физической зависимости от этанола [6, 30, 31] in vivo. Кроме того, изменение уровня мРНК КП Н и активности фермента под действием галоперидола [158, 219], глюкокортикоидов [19, 223, 277, 318] in vivo обуславливают интерес к изучению активности КП Н в условиях изменения функционирования медиаторных систем при введении галоперидола и диазепама.

 

Карбоксипептидаза М

Карбоксипептидаза М (КП М, КФ 3.4.17.2) была обнаружена Skidgel и соавторами в цитоплазматических мембранах периферических тканей и мозга [302].

Фермент широко распространен в человеческой плаценте, почках, легких [303], периферических нервах, головном мозге [241], желтом теле [333], гранулярных клетках растущих и незрелых фолликулов [333], эндотелиальных клетках кровеносных сосудов [289], лейкоцитах [116], Активность карбоксипептидазы М в нервной ткани на порядок ниже, чем в плаценте, а в периферических нервах выше, чем в головном мозге [241]. В мозге фермент обнаружен в клетках глиии, а также в комплексе с миелином и миелинформирующими клетками [241].

КП М является гликопротеином с Mr 62000 [118, 301]. Фермент представлен одной полипептидной цепью и связан с плазматической мембраной при помощи остатка гликозил-фосфатидилинозитола [118, 301]. При воздействии трипсина и фосфолипазы С КП М переходит в растворимую форму за счет удаления остатка гликозил-фосфатидилинозитола [118, 300]. Этот процесс возможен и in vivo, так как фермент обнаружен в моче и амниотической жидкости [300]. При химическом дегликозилировании образуется полипептид с Mr 48000, который состоит из 439 аминокислотных остатков [295, 303]. Аминокислотная последовательность фермента на 41% идентична КПN и КП Н, на 15% – КПВ и КПА. Многие остатки активного центра соответствуют таковым КПА и КПВ, но перекрестной реакции с антисыворотками к другим КП фермент не дает [303, 315].

Максимальная активность КП М отмечается при рН 7,0. В активном центре фермента находится ион Zn²⁺ [301]. Ионы Со²⁺ повышают активность КП М в 1,5 – 2 раза, причем степень активации возрастает при снижении рН [118]. Действие фермента ингибируется ионами Cd²⁺, о-фенантролином, 2-меркаптометил-3-гуанидилэтилтиопропановой кислотой и ГЭМЯК [118, 301]. HgCl₂, ФМСФ, апротинин, каптоприл и фосфорамидон не влияют на его активность [120, 301].

КП М отщепляет остатки только основных аминокислот, причем в отсутствие ионов Со²⁺ предпочтительней отщепляет аргинин, а в присутствии Со²⁺ – лизин. Фермент в большей степени проявляет эстеразную активность, чем пептидазную [118, 301]. In vitro КП М отщепляет остатки аргинина и лизина с С-конца Met⁵-энкефалин-Arg⁶, Met-энкефалин-Lys⁶, Leu⁵-энкефалин-Arg⁶, брадикинина, динорфина А_1-13 [120, 271, 301], фактора роста эпидермиса [189, 300], анафилотоксинов С3а, С4а и С5а [265], различных синтетических пептидов [118, 302].

Считают, что карбоксипептидаза М участвует в инактивации или модулировании активности пептидных гормонов до или после их взаимодействия с рецепторами, вовлекается в процессы клеточного роста и дифференциации. В связи с этим представляет интерес изучение активности КП М при введении галоперидола и диазепама.