Активность КП Н определяли модифицированным методом Fricker L.D. и Snyder S.H. [148].
Для определения активности фермента к 150 мкл (в случае опытной пробы) или 140 мкл (в случае контрольной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl (рН 5,6), добавляли 50 мкл гомогената ткани. В контрольные пробы, кроме того, добавляли 10 мкл 25 мкМ водного раствора ГЭМЯК. Пробы преинкубировались 8 мин при 37оС. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37°С 210 мкМ дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси составляла 42 мкМ). Далее пробы инкубировали 60 мин при 37оС. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора соляной кислоты.
Для экстракции продукта реакции – дансил-фен-ала – к пробам приливали 1,5 мл хлороформа и встряхивали в течение 60 сек. Для разделения фаз пробы центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин. Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 в кювете толщиной 1 см при lex=360 нм и lem=530 нм. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.
|
|
Активность КП Н определяли как разность в накоплении продукта реакции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
Метод определения активности карбоксипептидазы М
Определение активности КП М проводится по выше изложенной схеме, но в качестве буфера используется 200 мМ трис-HCl, рН 7,4 [148].
Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы
Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы определяли флюориметрическим методом [148]. Контрольные пробы содержали 140 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl (рН 5,6), 10 мкл 25 мМ раствора ФМСФ, приготовленного на этиловом спирте (конечная концентрация ФМСФ в реакционной смеси составляла 1 мМ) и 50 мкл гомогената. В опытные пробы вносили 150 мкл буфера и 50 мкл гомогената.
Дальнейшее определение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы проводилось так же, как и для КП Н, с той лишь разницей, что вместо дансил-фен-ала-арг в качестве субстрата использовали 50 мкл 210 мкМ дансил-фен-лей-арг. Активность фермента определяли как разность в накоплении продукта дансил-фен-лей в пробах, несодержащих и содержащих ФМСФ. Активность выражали в нмоль дансил-фен-лей образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
Количество белка в пробах определяли по методу Lowry и соавт. [217].
Статистическая обработка результатов исследования
Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента [37]. Корреляционный и дисперсионный анализы проводили с помощью программы Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США) в режимах Simple Correlation, One-Way ANOVA и Multifactor ANOVA. Принадлежность подгрупп животных к разным гомогенным группам оценивали с помощью Multiple range analysis (Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США)). Принадлежность экспериментальных (временных) подгрупп к разным гомогенным группам проводили только в случае достоверности критерия Фишера. При этом оценивали количество гомогенных групп, образуемых экспериментальными подгруппами, с уровнем достоверности р<0,05. Баллы подгруппам присваивали на основании их принадлежности к разным гомогенным группам по мере увеличения среднего. При этом минимальный балл получала временная подгруппа с минимальным средним, максимальный балл – временная подгруппа с максимальным средним, а дробный балл (1,5) получали подгруппы, входящие одновременно в две гомогенные группы. На основании присвоенных баллов судили о динамике изменения активности ферментов.
|
|
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс в норме и при действии психолептиков
Распределение активности карбоксипептидазы Н в тканях интактных крыс
Данные о распределении активности КП Н, полученные в ходе исследования, представлены в таблице 1.
Таблица 1. Активность КП Н у интактных животных (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М ± m, n = 7-8)
Отделы мозга, органы | КП Н M±m |
Гипофиз | 1,36±0,18 |
Гипоталамус | 0,29±0,02 |
Четверохолмие | 0,30±0,02 |
Мозжечок | 0,18±0,01 |
Стриатум | 0,21±0,01 |
Гиппокамп | 0,26±0,02 |
Большие полушария | 0,23±0,01 |
Надпочечники | 0,13±0,01 |
Семенники | 0,06±0,01 |
Максимальная активность КП Н обнаружена в гипофизе, где синтезируются пептидные гормоны. В остальных отделах мозга активность фермента в 5-6 раз ниже, чем в гипофизе (по убыванию): четверохолмие, гипоталамус, гиппокамп, большие полушария, стриатум и мозжечок. В надпочечниках и семенниках активность фермента в 10-20 раз ниже по сравнению с гипофизом. Такое распределение активности коррелирует с распределением биологически активных пептидов в отделах мозга [201].