Критически оцените методы определения антагонистической активности пробиотиков

Антагонистическую активность в отношении патогенных и условнопатогенных микроорганизмов оценивают как у штаммов-продуцентов, так и у препаратов пробиотиков, полученных на их основе. Определение антагонистической активности штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения, проводят с помощью метода отсроченного антагонизма. При проведении испытания применяют питательную среду, адекватную для данного вида бактерий (если нет других указаний в нормативной документации):

· для лактобактерий и бифидобактерий – среду МРС-5;

· для кишечной палочки и споровых пробиотиков – среду Гаузе № 2.

Тест-штаммы микроорганизмов (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Candida albicans). Их получают в лиофилизированном виде (в ампулах) из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (если нет других указаний в нормативной документации) с сертификатом соответствия (паспортом на штамм).

Ампулы с тест-культурами микроорганизмов вскрывают в асептических условиях в соответствии с инструкцией производителя. Для восстановления жизнеспособности культуры необходимо не менее двух пересевов на адекватной питательной среде (соответствующей потребностям используемого микроорганизма) с инкубацией в стандартных условиях. Для получения изолированных колоний второй пересев культуры тест-штамма проводят на адекватной плотной питательной среде при инкубации в стандартных условиях. Температура инкубации посевов бактерий (32,5 ± 2,5) оС, грибов  (22,5 ± 2,5) оС, если нет других указаний в нормативной документации. Для испытания используют культуры, выращенные в течение (22 ± 2) ч, второго или третьего пассажа, которые инкубируют на адекватной плотной питательной среде в адекватных условиях. Выросшую чистую культуру смывают 0,9 % раствором натрия хлорида с поверхности плотной питательной среды. Полученную суспензию собирают в стерильную посуду (флакон, пробирку и т.д.).

Методом случайной выборки отбирают образцы от каждой серии препарата. Посевы проводятся в стерильных условиях. Пробиотические производственные штаммы-продуценты (лиофилизаты) восстанавливают до первоначально высушенного объема (но не менее 107 микробных клеток/мл), добавляя в лиофилизат стерильный 0,9 % раствор натрия хлорида.

Полученную суспензию испытуемого образца перемешивают и высевают бактериологической петлей диаметром (3,5+0,5) мм на 6 чашек Петри с питательной средой, проводя по 2 параллельных штриха длиной, равной диаметру чашки. После инкубирования в течение 48–96 ч при температуре (37 + 1) оС в адекватных (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных) условиях в зависимости от вида микроорганизма к выросшей культуре испытуемого образца подсевают культуры тест-штаммов (в соответствии с требованиями нормативной документации). Подсев тест-штаммов производят петлей диаметром (1,75 + 0,25) мм в направлении, перпендикулярном зоне роста изучаемого микроорганизма, и не касаясь его. Чашки Петри перевернутые вверх дном инкубируют при температуре (37 + 1) оС в течение 18–20 ч (если нет других указаний в нормативной документации). Контролем роста тест-штаммов служит их параллельный посев на чашки с той же питательной средой без испытуемой культуры.

Учет результатов. Учитывают величину зоны отсутствия роста тест-штамма, выраженную в мм. Чем больше величина угнетения роста тест-культур, тем выше антагонистическая активность испытуемого штамма. Если нет других указаний в нормативной документации, антагонистическую активность штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения, считают высокой, если:

· зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 20 мм для штаммов-продуцентов, входящих в лактосодержащие пробиотики;

· зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 15 мм для штаммов-продуцентов, входящих в коли-, бифидосодержащие пробиотики.

· зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 10 мм - для штаммов-продуцентов, входящих в споросодержащие пробиотики

МОЖНО ЕЩЕ ТАК

Все разработанные к настоящему времени методы определения антагонистической активности микроорганизмов традиционно принято делить на две группы: методы in vitro (в искусственных условиях) и методы in vivo (в живом организме). Термин «in situ» применительно к биологии означает, что явление изучается там, где оно естественно и происходит (например, непосредственно в сыре или в ферментере), то есть, без перемещения его в искусственную среду. Таким образом, методы in vivo можно рассматривать как частный случай методов in situ.

Методы in vitro. Эти методы позволяют довольно просто и быстро проверить большой массив штаммов молочнокислых бактерий и/или тест-культур нежелательных микробов (санитарно-показательных, патогенных или технически-вредных). Различают диффузионные методы и тестирование в жидких питательных средах.

Диффузионные методы (метод перпендикулярных штрихов, метод блоков или лунок, метод капель и т. п.) основаны на диффузии антибиотических веществ, образуемых испытуемыми штаммами лактобактерий, в толщу агаровой среды, содержащей тест-культуру и подавляющей рост последней. Для объективной оценки антагонистического действия лактобактерий, выявляемого этим методом, необходимо учитывать, что он дает преимущество штаммам, продуцируемым ингибиторные соединения небольшой молекулярной массы, которые быстрее диффундируют в толще агарового слоя и, следовательно, дают более обширные зоны ингибирования роста тест-культуры. Этот метод имеет, однако, существенный недостаток: продуцент антибиотического вещества и тест-организм выращивают на одной среде, хотя известно, что не всегда одна и та же среда одинаково благоприятна как для продуцента и образования им антибиотика, так и для роста тест-организма.

При использовании метода блоков испытуемую культуру лактобактерий высевают глубинным способом в питательный агар в чашке Петри и инкубируют в оптимальных, строго соблюдаемых, условиях для образования и накопления в агаре ингибиторных соединений. Затем стерильным пробочным сверлом вырезают агаровый диск (блок) с выросшей культурой лактобактерии и устанавливают его в другой чашке Петри на поверхности агаровой среды, только что засеянной культурой тест-штамма. Чашку выдерживают в течение определенного времени в холодильнике (во избежание преждевременного роста тест-штамма) для диффузии ингибиторных соединений из блока в толщу агара с тест-штаммом, а затем инкубируют в определенных условиях, оптимальных для тест-штамма. О степени антагонистической активности испытуемой лактобактерии судят по величине зоны ингибирования роста тест-штамма вокруг агарового блока. Для тест-штамма в чашке Петри целесообразно формировать двухслойный агар. В отличие от метода перпендикулярных штрихов, метод блоков дает возможность сравнить на одной чашке несколько (4-8) штаммов лактобактерий к данной тест-культуре. Преимуществом метода блоков является то, что он позволяет использовать разные по составу питательные среды: одну (блок) - для испытуемой лактобактерии, другую - для использования данного тест-штамма. Кроме того, он удобен для изучения влияния состава питательной среды на продукцию ингибиторных соединений исследуемым штаммом лактобактерий.

Метод лунок схож с вышеописанным методом агаровых блоков, но в этом случае взамен установки блока в слое агара, содержащего тест-штамм, пробочным сверлом вырезается лунка диаметром 5-7 мм и в нее помещают определенное количество (например, 0,2 см3) жидкой или полужидкой среды с выросшей культурой исследуемого штамма лактобактерий. Чашку выдерживают в холодильнике для диффузии ингибиторных веществ из лунки в толщу агара, далее - в термостате для роста тест-штамма, после чего измеряют зону ингибирования тест-штамма вокруг лунки. Методом лунок можно определять антагонистическую активность чистых и смешанных молочных культур лактобактерий, например, сравнить по этому показателю различные коммерческие кисломолочные продукты. К недостаткам метода можно отнести опасность подтекания жидкости с культурой лактобактерий из лунки в щель между агаром и дном чашки, что ведет к искажению результата. Избежать подтекания можно путем формирования лунки, не доходящей до дна чашки, используя при заливке чашки агаровой средой соответствующие шаблоны (как это делается для электрофореза в агарозном геле). Альтернативный вариант - использование двухслойного агара (нижний слой - плотный, верхний - полужидкий агар, каждый слой по 10 см3/чашку), при этом лунка вырезается только в верхнем слое.

При использовании метода агаровых слоев исследователи применили модификации, позволяющие дифференцировать продукцию бактериоцинов (высокая молекулярная масса) и микроцинов (низкая молекулярная масса). В первом случае на поверхность плотной питательной среды МРC-4 наносили бляшками (4-8) лактобациллы и культивировали при температуре 37ºС в течении 48 часов. Далее на крышку чашки наносили 5 мл хлороформа, оставляя чашки перевернутыми в течении 5 минут. Убитые в парах хлороформа бактерии помещали в термостат на 30 минут для испарения хлороформа. Затем на чашки наслаивали 0,7% полужидкого мясо-пептонного агара с равномерно распределенной в нем тест-культурой и вновь культивировали при 37ºС в течении ночи. Положительный результат учитывали по появлению вокруг бляшки зоны отсутствия роста.

Во втором случае с целью индикации микроцинов (бактериоцинов с низкой молекулярной массой) на поверхность плотной среды МРС-4 с нанесенными, выросшими и обработанными в парах хлороформа бляшками, накладывали стерильный целлофан. Сверху на целлофан наносили 3 мл 0,7% агара, содержащего 107 клеток тест-культуры, взятой в экспоненциальной фазе роста. Культуры инкубировали 18-20 часов при 37ºС. Вокруг колоний, продуцирующих микроцины, появлялись зоны задержки роста индикаторных штаммов. Несомненным преимуществом данного метода является возможность дифференцировать продукцию бактериоцинов, а недостатком – высокая трудоёмкость процесса.

Некоторые исследователи, изучая антагонистические свойства лактобактерий, применяли метод капель, согласно которому на поверхность подсушенной агаровой среды наносят капли культур лактобактерий и после инкубации чашек (для роста лактобактерий и продуцирования ими ингибиторных веществ) поверх агара наливают слой полужидкой агаровой среды, содержащей тест-штамм, и вновь инкубируют (до появления зон ингибирования роста тест-штамма). в этом случае, в отличие от диффузионных методов (методов «отсроченного антагонизма»), происходит непосредственное взаимодействие исследуемых партнеров.

Лучшие результаты дает метод капель, который позволяет более полно выявлять бактериоциногенные штаммы и исключает появление зон ингибирования, обусловленных действием молочной кислоты или перекиси водорода.

В основе второй группы методов in vitro определения антагонистической активности молочнокислых бактерий лежит принцип тестирования в жидких питательных средах. Эти методы заключаются в том, что тест-культуру выращивают в оптимальной для нее жидкой питательной среде, к которой добавлено то или иное количество бесклеточной культуральной жидкости исследуемого штамма-антагониста или тест-штамм совместно выращивают со штаммом-антагонистом. О наличии и степени антагонистического действия судят по угнетению роста или метаболитической тест-штамма в сравнении с контролем (параллельная культура тест-штамма без добавления бесклеточной культуральной жидкости исследуемой лактобактерии). О росте тест-штамма судят по численности клеток (определяют турбидиметрическим методом или высевом разведений на плотную среду с последующим подсчетом КОЕ), а о его метаболитической активности - по какому-либо характерному для тест-штамма наглядному признаку, например, по скорости восстановления трифенилтетразолия. Наибольший интерес представляет метод совместного культивирования молочнокислых бактерий с тест-организмами, поскольку он позволяет в естественной для молочнокислых бактерий среде (например, в молоке) определить их антагонистические свойства.

Методы in situ могут быть осуществлены путем проведения опытных выработок, например, сыров или кисломолочных продуктов с точным соблюдением всех параметров соответствующего технологического процесса, с использованием в закваске испытуемого штамма-антагониста при заданном исходном уровне заражения тест-микробом и учетом последующей численности этого тест-микроба в полуфабрикатах и готовом продукте; они могут также заключаться в постановке опытных выработок продукта с использованием штамма-антагониста и статистическом учете численности естественной санитарно-показательной микрофлоры этого продукта в сравнении с контрольными выработками.

В свою очередь, методы in vivo предусматривают скармливание подопытным животным, инфицированным тест-микробом, штамма-антагониста с последующим выявлением тест-микроба в кале или прием пробиотических препаратов людьми при различных дисбиотических состояниях с последующим анализом качественных и количественных изменений в микрофлоре кишечника.

Данные методы используют при клинических испытаниях уже готовых пробиотических препаратов, бакконцентратов, заквасок и т. п. Применение этих методов позволяет выявить степень влияния не только штамма-антагониста и тест-штамма друг на друга, но и проследить их взаимодействие как с естественной кишечной микрофлорой, так и с организмом хозяина в целом. Организм животного или человека в данном случае – среда, в которой молочнокислые бактерии будут проявлять антагонистический эффект к тест-штамму, здесь имеет место совокупность, многофакторность, комплексность условий, в которых происходит этот процесс и поэтому, эти результаты наиболее значимы для промышленного и медицинского применения антагонистически активных штаммов молочнокислых бактерий.