Методические приемы культивирования

 

Первые работы по изучению антибиотических свойств высших базидиомицетов начались сразу после открытия пенициллина. На активность против различных патогенных микроорганизмов, вызывающих инфекционные заболевания, тестировали водные и спиртовые экстракты из плодовых тел, собранных в природе, а затем и экстракты из мицелия и культуральную жидкость грибов, выращенных на жидких средах. Именно в этот период были созданы наиболее известные мировые коллекции чистых культур грибов, которые стали базой не только для развития грибоводства, но и для многих экспериментальных исследований и разработки современных методов культивирования базидиомицетов.

Уже к 1965 г. в разных лабораториях мира было проверено около 3 тыс. видов макромицетов и определена химическая природа свыше 40 антибиотиков. Итоги дальнейших исследований в этом направлении, показавшие наличие слабой антибиотической активности у очень широкого круга видов базидиальных грибов, эти данные обобщены в ряде обзорных работ. Хотя химическая природа антибиотических веществ макромицетов весьма разнообразна, есть соединения, которые чаще встречаются у грибов различных таксонов.

· Экстенсивный способ выращивания предусматривает выращивание грибов в естественных условиях. Его недостатком является сезонность сбора плодовых тел и зависимость величины урожая от климатических условий. Технология выращивания грибов экстенсивным способом не требует больших затрат. При этом используют отходы лесозаготовительной промышленности (низкокачественная древесина, пни, стружка, кора и т. д.).

· Интенсивный метод предполагает культивирование плодовых тел в специальных помещениях, где есть возможность регулировки условия микроклимата.

Достоинства интенсивного способа:

- процесс выращивания грибов проводится круглогодично;

- урожайность более высокая и стабильная;

- используется большее количество субстратов из ряда целлюлозно-лигнино содержащих отходов сельского хозяйства и промышленности в связи с наличием в технологическом процессе фазы их тепловой обработки;

- более короткий производственный цикл, равный 8-10 неделям;

- возможность применения механизации и автоматизации технологических процессов.

Одним из существенных условий успешного проведения выращивания мицелия является правильная подготовка посевного материала – инокулюма [12,с. 238]. До посева на жидкую среду мицелий сохраняют на твердых питательных средах различного состава в зависимости от биологических особенностей штамма.

· Биотехнологические приемы наращивания биомассы базидиальных грибов в глубинной культуре предусматривают использование питательной среды, близкой по составу природным субстратам.

Стереум, являясь дереворазрушающими грибами, для своего питания использует среду, которая содержит целлюлозу и лигнин. Поэтому исходными материалами для приготовления субстратов при их выращивании используют разное сырье растительного происхождения: древесную кору, опилки и стружку, лигнин – отходы целлюлозно-бумажного производства и т.п.

Для выращивания лучше всего подходит наиболее выгодный метод картофельно-сахарозный агар. Помимо питательных элементов и воды, важным составляющим этой среды является агар. Он позволяет зацементировать среду в единое целое, придав ей твердый вид.

Засев поверхности питательного агара обычно происходит спорами или кусочком грибницы. Грибы прекрасный объект для исследований обмена веществ в организме. Чистая культура грибов позволяет максимально упрощенно получить ответы на многие вопросы: о роли того или иного питательного элемента в жизни клеток, скорости операций превращения различных веществ, зависимости развития от тех или иных условий и т. п.

Чистая культура – совокупность организмов одного вида, имеющих одинаковые морфологические и биохимические свойства и одинаковые свойства их культур [12,c.144]. Зачастую используют чистую культуру в микробиологической, микологической и др. промышленности в качестве исходного материала для получения ферментов, вакцин, антибиотиков, витаминов, стероидных гормонов и других продуктов. Чистая культура применяется также для проведения научно-исследовательских работ. Важной задачей является поддержание чистой культуры в состоянии, при котором объект может быть использован в практических целях. Чистую культуру грибов Stereum hirsutum достигают путем постоянного пересевана твердую питательную среду картофельно-сахарозный агар, с соблюдением температурного режима 24-26 °С в течение 5-7 суток. Одну из чашек Петри используют для дальнейшего размножения чистой культуры, остальные хранят для последующих циклов. Для сохранения чистоты культуры важно соблюдение стерильных условий. Культуры стереума стали предметом исследования на определения антимикробных свойств.

Различные грибы, многие из которых у нас не встречаются, применяются в народной медицине Китая, Тибета и ряда других стран. В последнее время для получения из грибов новых лекарственных средств проводятся исследования в Англии, США, Чехии, Болгарии, Индии и других странах. Предположения подтверждаются – во многих грибах были обнаружены антибиотики различного спектра действия [32,с. 22]. Оказалось, что уже не два-три вида, а целый ряд шляпочных грибов можно применять при лечении различных болезней. Особое место среди них занимают шампиньоны, тем более их легко выращивать в искусственных условиях. Эти грибы также обладают антибиотическими свойствами. В них обнаружен антибиотик агаридоксин, убивающий многие болезнетворные микроорганизмы.

На данный момент в нашей стране тоже ведутся исследование грибов на важнейшие биологически активные вещества (БАВ), противоопухолевые, антиоксидантные, антимикробные свойства и прочее. Аналогом широко известного шампиньона в Беларуси является вешенка. Многие работы исследователей говорят о том, что все грибы содержат в себе то или иное количество антимикробных веществ, БАВ и других немало важных продуктов, которые могут быть полезны в фармакологии, медицине, пищевой промышленности и т.д. Образование антибиотиков грибами, имеет эволюционно приспособленный характер и тесно связано с общими процессами метаболизма грибов в природе и при культивировании. Стабильность образования их, образуемых различными видами грибов, неодинакова.

Грибы (Eumycota) отличаются от других организмов особым свойством – гетерогенностью своих физиолого-биохимических свойств. Другими словами, определенные систематические группы грибов более близки растениям, а другие более близки с животными организмами. Гетерогенность физиолого-биохимических свойств грибов оказалась очень удобным свойством для биотехнологов, так как из этих низших эукариотов оказалось возможным получать биологически активные вещества (БАВ), продуцентами которых ранее были животные, растения и бактерии.

В последнее десятилетие грибы рассматриваются как наиболее прогрессивные источники получения эссенциальных жирных кислот – линолевой и линоленовой, а также арахидоновой [26,с. 171]. Эти свойства грибов, а также их способность наращивать при глубинном культивировании большие объемы биомассы за сравнительно короткие сроки ферментаций, возможность использовать дешевые среды (отходы других производств), получать во время одной ферментации несколько конечных продуктов, неограниченность производства и их экологическая чистота. Все это способствовало тому, что именно грибы заняли первое место, как наиболее используемые продуценты в биотехнологических производствах.

В России к 60-м годам прошлого века была сформирована экспериментальная база для изучения биологически активных базидиомицетов нынешнее название – лаборатория биохимии грибов в Батаническом институте им. В.Л. Комарова. Эта лаборатория получила развитие простых и надежных методов тестирования характера биологической активности у грибных организмов и их метаболитов сдерживало развитие исследований. Тем не менее, использование биологических и химических тестов позволило выявить и оценить характер активности многих макромицетов, собранных на территории России.

На территории Беларуси также есть лаборатория микологии в государственном научном учреждении «Институт экспериментальной ботаники имени В.Ф. Купревича Национальной академии наук Беларуси» и не менее значимая организация «Институт леса Национальной академии наук Беларуси». В лаборатории микологических и лихенологических исследований, специалистами было выявлено большое количество ранее неизвестных для страны видов грибов и лишайников. А в 2006 г. был издан каталог «Макромицеты, микромицеты и лихенизированные грибы Беларуси». Последнее десятилетие активно создаются лекарства на основе природных продуктов. Производство таких лекарств, в различных странах мира, стало конкурировать наряду с высоко эффективным скринингом, комбинаторной химией и генетическими исследованиями. В создании лекарственных препаратов на основе природных компонентов При этом зарубежные фармацевтические компании столкнулись с трудностями получения биологического материала из других стран в связи с Конвенцией по Биологическому разнообразию. Предпринятые в связи с выполнением программы по «Биологическому разнообразию», предоставляют новые возможности для поиска биологически активных соединений среди высших грибов. Вовлечение в область исследовании грибных организмов, редко встречающихся со сложной трофикой и экологией, не только позволит расширять список практически значимых видов, но будет способствовать получению новой информации по их биологии, химии и генетике.

 

 

1.6 Питательные среды и субстраты для культивирования исследуемого гриба S. hirsutum

 

Культивирование грибов, как и микроорганизмов, можно поводить поверхностным или глубинным, периодическим или непрерывным методами, в аэробных или анаэробных условиях. Большое значение при выборе способа культивирования имеет отношение выбранного для культивирования организма к молекулярному кислороду и конечная цель культивирования: накопление биомассы или получение определенного метаболита (спирта, кислорода, фермента и т.д.).

Используемые в биотехнологии субстраты разнообразны и их спектр непрерывно расширяется. С развитием промышленных процессов происходит накопление новых видов отходов, которые могут быть обезврежены и превращены в полезные продукты методами биотехнологии. В настоящее время наблюдается рост интереса биотехнологов к природным возобновляемым ресурсам – продуктам фотосинтеза, биоресурсам мирового океана. В состав сред для биотехнологических процессов входят источники углерода и энергии, а также минеральные элементы и ростовые факторы.

Минеральные элементы, необходимые для роста биологических агентов и входящие в состав питательных сред, подразделяются на макро- и микроэлементы. Среди макроэлементов на первом месте стоит азот, так как потребность в нем у биологических объектов на порядок выше, чем в других элементах (фосфоре, сере и др.). Азот необходим организмам для обеспечения синтеза нуклеиновых кислот, белков и полимеров клеточной стенки. Источники азота, используемые в промышленном культивировании также разнообразны. Среди них могут быть простые (аммиак и соли аммония, мочевина), и сложные (картофельный экстракт, соевая мука, рыбная мука, дрожжевой экстракт и др). Однозначного предпочтения простым или сложным источникам азота отдать нельзя: простые позволяют точно контролировать состав питательной среды и точно задавать содержание в ней азота. Для микроорганизмов Pseudomonas Aeruginosa, Esherichia Coli, Enterococcus Faecealis, Staphilococcus Soprofiticus использовали ГРМ – эта питательная среда предназначена для культивирования различных микроорганизмов. Представляет собой мелкодисперсный гигроскопичный порошок светло-желтого цвета. Состоит из пептон сухой ферментативный, панкреатический гидролизат рыбной муки, натрия хлорид, агар. Для грибов минеральные элементы необходимы для роста любого биологического агента, но их концентрация в среде, в зависимости от биообъекта и задач биотехнологического процесса, различна.

Многие из съедобных базидиальных грибов являются ауксотрофными, т. е. для своего роста нуждаются в определенных факторах роста – витаминах, аминокислотах и т. д. Главную роль в питании грибов играют углеродсодержащие субстраты, обеспечивая грибной организм углеродом, необходимым для синтеза веществ живой клетки, и участвуя в процессах окисления, где являются единственным источником энергии. Высшие базидиальные грибы, к которым относится большинство известных съедобных, являясь экологически неоднородной группой, сталкиваются в природе с большим разнообразием углеводов, чаще всего с полимерными формами простых сахаров. Поэтому при искусственном культивировании съедобные грибы предпочитают сахара другим источникам углерода. Существует мнение, что глюкоза является универсальным источником углерода для всех грибов, хотя она и не всегда обеспечивает максимальный рост мицелия. Для большинства съедобных грибов фруктоза является таким же хорошим источником углерода, как и глюкоза. Из дисахаридов грибами используются мальтоза, целлобиоза: сахароза, по мнению многих исследователей, не является универсальным источником углерода, а лактоза использовалась наименьшим количеством исследованных штаммов.

Большинство высших базидиомицетов в природе принимают участие в разложении целлюлозы и хорошо используют этот высокомолекулярный углевод при искусственном культивировании. Лигнин используется многими дереворазрушающими и подстилочными грибами, однако в культуре грибы, как правило, должны быть адаптированы к этому источнику углерода. Наиболее доступен для базидиальных грибов так называемый биологический лигнин. В процессе разложения древесины разрушаются связи клетчатки с лигнином, что делает его доступным для питания гриба. Многие дереворазрушающие грибы хорошо используют лигносульфонат кальция, содержащийся в сульфитном щелоке – отходе целлюлозно-бумажной промышленности. Так к дереворазрушающим грибам относится S. hirsutum. Потребности этого гриба в микроэлементах невелики, поэтому его часто специально не вносят в среду, так как его примеси в основных солях и воде обеспечивают потребности продуцентов. Помимо чистых индивидуальных веществ на практике часто используют в качестве ростовых добавок картофельный или дрожжевой экстракт, отходы пищевой промышленности. Добавление ростовых факторов способно увеличить выход целевого продукта в десятки раз. Следует учесть оптимальную для роста культуры температуру, она не всегда совпадает с таковой для накопления целевого продукта. Перемешивание культуры также является важным фактором роста, потому что клетка для своего развития потребляет питательные вещества, в связи с этим вокруг клетки постепенно образуется пространство с пониженной концентрацией этих веществ, так что возникает градиент концентрации питательных веществ [4,с. 550]. Со временем этот градиент начинает лимитировать рост клетки и всей культуры. При культивировании гриба S. hirsutum культуру постоянно помешивали на шейкере и получали методом глубинного культивирования (in vitro). Исследователь при культивировании грибов может преследовать разные цели и задачи, целью этой работы явилось изучить антимикробную активность малоизученного гриба S. hirsutum на предмет антимикробной активности. Определение наличия антимикробных веществ в культуральной жидкости и экстракте S. hirsutum и можно пронаблюдать на тест-объекте ДДМ, т.е. на микроорганизмах: Pseudomonas Aeruginosa, Esherichia Coli, Enterococcus Faecealis, Staphilococcus Soprofiticus. Для культивирования микроорганизмов компоненты питательной среды имеют схожий состав, иными словами важной задачей микроорганизмов и грибов в росте и развитии – это наличие биохимических факторов роста. Существуют также и биофизические факторы роста, к которым относят физические условия, обеспечивающие нормальный рост культуры: это температура культивирования и интенсивность перемешивания (для обеспечения необходимого массообмена в культуре). Различные продуценты имеют определенный диапазон температур, при которых их рост происходит наиболее эффективно. Поэтому для каждого вида организма необходимо соблюдать параметры благоприятно сказывающихся на рост и развитие.

Выбор процесса культивирования зависит не только от потребностей организма, но и от того, для чего будет использована культура, а точнее от конечной цели эксперимента.

Известно много процессов культивирования. Они различаются по наиболее важным показателям:

· Состояние питательной среды (поверхностные и глубинные)

· Наличию или отсутствию перемешивания (динамические или статические);

· Содержанию кислорода (аэробные или анаэробные);

Поверхностное культивирование обеспечивает наиболее близкие к физиологическим условия роста гриба S. hirsutum. Однако рост гриба происходит обычно медленно из-за отсутствия эффективного массопереноса и стерических ограничений. Трудно наладить эффективный теплообмен, в особенности если используются толстые слои среды.

Метод глубинного культивирования обладает целым рядом преимуществ по сравнению с поверхностным выращиванием. Механическое перемешивание и непрерывная аэрация создают благоприятные условия для доступа питательных веществ и кислорода ко всем клеткам мицелия гриба S. hirsutum, обеспечивая одинаково благоприятные условия для роста и накопления продуктов метаболизма. Глубинное выращивание проводится строго в определенных условиях, соответствующих физиологическим потребностям гриба, с соблюдением стерильности на всех этапах процесса. Глубинный процесс более экономичен, так как при этом сокращается срок ферментации и увеличивается количество получаемого продукта. Однако глубинный метод требует специального дорогостоящего оборудования с высокой регулировкой ферментационного процесса, с подачей большого количества стерильного воздуха. Непрерывное культивирование в 3-4 раза ускоряет адаптацию по сравнению со стационарной культурой и способствует селекции более активных рас. Для выращивания грибов, являющихся аэробами, в глубинных слоях жидкой культуры требуется дополнительная аэрация, так как грибы используют только растворенный кислород. Культивирование Stereum hirsutum было проведено глубинным методом (in vitro) на шейкере, с соблюдением температуре 24^оС в термостате. Прорастание культуры дает возможность использовать культуральную жидкость, которая используется в ДДМ для определения антимикробной активности.

 

ГЛАВА 2