Материалы и методы исследований

 

Работа по изучению гриба Stereum hirsutum выполнена в лаборатории ПолесГУ. Основное исследование направлено на получение культуры и изучение антимикробной активности культуральной жидкости, экстракта гриба S. hirsutum и его мицелия при поверхностном культивированиив сравнительной характеристике. Для проведения исследования по поставленной цели, проделана следующая работа:

* Собраны в природе грибы Stereum hirsutum и Pleurotus ostreatus.

* Получены экстракты из тел Stereum hirsutum и изучение их антимикробного влияния

* Получены чистые культуры грибов Stereum hirsutum из собранных в природе плодовых тел методом поверхностного культивирования.

* Использован метод глубинного культивирования S. hirsutum для получения мицелия и культуральной жидкости.

* Использован метод поверхностного культивирования S. hirsutum для получения мицелия.

* Выполнено культивирование поверхностным методом микроорганизмов Pseudomonas Aeruginosa, Esherichia Coli, Enterococcus Faecealis, Staphilococcus Soprofiticus как тест-объектов при определении антимикробной активности культуральной жидкости и экстракта гриба S. hirsutum.

* Применен диско диффузионный метод определения антимикробной активности гриба Stereum hirsutum.

* Для уяснения зависимости использовали культуральную жидкость, экстаракт грибов Stereum hirsutum и его мицелий при поверхностном культивировании, сравнивая радиусы действия антимикробных свойств на указанных выше микроорганизмах.

* Контролем служили промышленные стандартные образцы антибиотиков: офлоксацин, бензилпенициллин, левомицетин, рифампицин. Образцы этих антибиотиков хранились и использовались в соответствии с рекомендациями указанными на этикетке стандартного образца.

2.1 Получение экстрактов из тел Stereum hirsutum

 

Для получения экстрактов и определения антимикробной, антиоксидантной и противоопухолевой активности экстрагировали плодовые тела грибов собранные в природе.

В получении экстракта понадобилось:

-Масса измельченного гриба

-NaCl

Для этого грибы гомогенизировали, добавляли изотонический раствор хлористого натрия в соотношении масса гриба:NaCl– 1:10, оставляли на 12-14 часов при 3-4 °С, центрифугировали при 3,5 тыс. об./мин, супернатант использовали для дальнейших исследований [3, c. 331]. При получении готового экстракта можно использовать его, чтобы определить наличие антибиотика в интересуемом грибе. Антимикробные свойства наблюдались диско диффузионным методом.

 

 

2.2 Получение чистой культуры гриба Stereum hirsutum из маточной культуры, собранной в природе, методом поверхностного культивирования

 

Чистая культура гриба высеивалась на плотную питательную среду.

Состав плотной питательной среды:

200 г картофеля

500 мл водопроводной воды

10 г сахарозы

10 г агара

Приготовление: 200 г очищенного мелконарезанного картофеля заливали 500 мл водопроводной воды, кипятили 20 мин, фильтровали через два слоя марли или ватно-марлевую повязку. Доводили водой до исходного объёма (500 мл). Добавляли 10г. Сахарозы и 10 г агара [3,c. 550]. Разлив по колбам, закупоривали пробками. Далее помещали в автоклав на 15 минут, а после автоклавирования дали остыть среде до комнатной температуры и под ламинаром разливали по чашкам Петри. Остывшая и затвердевшая питательная среда была пригодна для засева чистой культурой. Прорастание культуры проходило в термостате при температуре 24-26°С в временном интервале 5-7 суток.

 

2.3 Метод глубинного культивирования S. hirsutum для получения мицелия и культуральной жидкости

 

Состав жидкой питательной среды:

200 г картофеля

500 мл водопроводной воды

10 г сахарозы

Приготовление: 200 г очищенного мелконарезанного картофеля заливают 500 мл водопроводной воды, кипятят 20 мин, фильтруют через два слоя марли или ватно-марлевую повязку. Доводим водой объем до исходного объёма 500 мл. Добавляем 10г. сахарозы. Разливаем по колбам, закрываем пробками. Помещаем в автоклав на 15 минут. После автоклавирования делаем пересев под ламинаром. Несколько небольших кусочков предыдущей чистой культуры шпателем переносим в жидкую среду, закрываем колбу и ставим на шейкер с оборотами от ±20. При температуре 24-26 °С в течение 5-7 суток в термостате.

При культивировании на качалках или в ферментерах небольшой емкости посевной мицелий (инокулюм) выращивают обычно на жидкой среде в колбах Эрленмейера поверхностно или глубинно. Чтобы получить однородный посевной материал, засевать колбы нужно одинаковым количеством мицелия (обычно с одного косяка засевают 1-2 колбы Эрленмейера на 250-500 мл), выращивать в течение одинакового периода времени и при одинаковой температуре.

В случае глубинного выращивания инокулюма грибов измельченным мицелием засевают колбы или пробирки с жидкой средой и выращивают на круговых качалках до образования заметной (в виде мелких комочков) биомассы при температуре 24-26 °C[3,c.550]. При этом обеспечиваются высокая плотность клеток и большое количество растущих точек.

Согласно немногочисленным литературным данным, расход воздуха в начале культивирования составляет примерно 1 объем воздуха на 1 объем среды в 1 минуту. К концу прорастания, когда накапливается большое количество мицелия, расход воздуха может быть увеличен, поэтому число оборотов мешалки увеличивается по мере нарастания биомассы.

 

 

2.4 Метод поверхностного культивирования S. Hirsutum для получения мицелия

 

Чистая культура гриба высеивалась на плотную питательную среду.

Состав плотной питательной среды:

200 г картофеля

500 мл водопроводной воды

10 г сахарозы

10 г агара

Приготовление: 200 г очищенного мелконарезанного картофеля заливали 500 мл водопроводной воды, кипятили 20 мин, фильтровали через два слоя марли или ватно-марлевую повязку. Доводили водой до исходного объёма (500 мл). Добавляли 10г. Сахарозы и 10 г агара [3,c. 550]. Разливали по колбам, закупоривали пробками. Далее помещали в автоклав на 15 минут, а после автоклавирования дали остыть среде до комнатной температуры и под ламинаром разливали по чашкам Петри. Остывшая и затвердевшая питательная среда была пригодна для засева чистой культурой. Прорастание культуры проходило в термостате при температуре 24-26°С в временном интервале 5-7 суток.

Чашку с выросшей культурой залили водой (5 мл). Скальпелем сняли поверхностный слой мицелия гриба и выдержали один час. Полученную жидкость использовали при определении антимикробной активности мицелия при поверхностном культивировании с помощью диско диффузионного метода.

 

 

2.5 Микроорганизмы Pseudomonas Aeruginosa, Esherichia Coli, Enterococcus Faecealis, Staphilococcus Soprofiticus как тест-объекты при определении антимикробной активности гриба

В качестве тест-объекта для определения антимикробной активности использовались следующие микроорганизмы:

· Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) обнаруживается при абсцессах и гнойных ранах, ассоциирована с энтеритами и циститами. Факторами патогенности P. aeruginosa является наличие подвижности, токсинообразование, продукция гидролитических ферментов. Прогноз ухудшается высокой резистентностью к действию антибиотиков. P. aeruginosa устойчива к действию многих беталактамов, аминогликозидов, фторированных хинолонов.

P. aeruginosa – вид грамотрицательных подвижных палочковидных бактерий. Обитает в воде, почве, условно патогенна для человека, возбудитель нозокомиальных инфекций у человека. По форме прямая или искривлённая с закруглёнными концами палочка, размеры: 1-5 на 0,5-1,0 мкм. Относится к хемоорганогетеротрофам, облигатный аэроб. Растёт на питательных средах: МПА (среда окрашивается в сине-зелёный цвет), МПБ (в среде помутнение и пленка, также сине-зелёный цвет). Соблюдение температур 42 °C, оптимальной температурой является 37 °C. Образует протеазы. Продуцирует характерные пигменты: пиоцианин (феназиновый пигмент, окрашивает питательную среду в сине-зелёный цвет, экстрагируется хлороформом), пиовердин (желто-зелёный флюоресцирующий в ультрафиолетовых лучах пигмент) и пиорубин (бурого цвета).

· Esherichia coli – вид грамотрицательных палочковидных бактерий, широко распространённых в нижней части кишечника теплокровных животных. Большинство штаммов E. coli являются безвредными.

Оптимальный рост достигается культурами E. coli при температуре 37°C, некоторые штаммы могут делиться при температурах до 49°C. Рост может стимулироваться аэробным или анаэробным дыханием. Бактерии легко могут быть выращены в лабораторных условиях, поэтому кишечная палочка играет важную роль в генетических исследованиях. E. coli является одним из самых изученных прокариотических микроорганизмов и одним из самых важных объектов биотехнологии и микробиологии. E. coli вызывает огромное количество заболеваний, в таких случаях в лечение включается применение антибиотиков. Антибиотики применяются таким образом, чтобы не подавлять нормальную микрофлору кишечника, иначе возможно развитие дисбактериоза. E. coli очень чувствительна к таким антибиотикам, как стрептомицин или гентамицин. Однако она может быстро приобретать лекарственную устойчивость.

· Enterococcus faecealis – вид бактерий рода энтерококков, входящий в состав нормальной микрофлоры пищеварительного тракта человека, а также некоторых млекопитающих. По принятой ранее классификации энтерококки относились к стрептококкам группы D и E. faecium назывались Streptococcus faecium. E. faecium – это молочнокислые грамположительные бактерии, не образующие спор и капсул, факультативные анаэробы (способные использовать энергию брожения поэтому, жить и при больших и при ничтожных количествах кислорода). Оптимальная температура культивирования энтерококков +36 °С.

Энтерококки осуществляют метаболизм бродильного типа, ферментируют разнообразные углеводы с образованием в основном молочной кислоты, Энтерококки высокорезистентны к различным факторам внешней среды и дезинфицирующим средствам, могут длительное время сохранять жизнеспособность на предметах домашнего обихода, выдерживают нагревание до 60 °С в течение 30 минут.

· Staphilococcus Soprofiticus – неподвижные грамположительные кокки, диаметр клетки которых составляет от 0,6 до 1,2 мкм. Для представителей рода характерно деление в нескольких плоскостях, результатом чего есть расположение микробных клеток “виноградными гроздьями” в чистой культуре. Они факультативные анаэробы, хемоорганотрофы с окислительным и ферментативным типом метаболизма.

Формы колоний на плотных питательных средах – округлые, выпуклые, пигментированные (белые, желтые, золотистые). На жидких – равномерное помутнение. Широко распространены в почве, воздухе, представители нормальной кожной микрофлоры человека и животных. В состав этого рода входят патогенные и условно патогенные для человека виды, колонизирующие носоглотку, ротоглотку и кожные покровы. Может вызывать острый цистит и уретрит. Лечение затруднительно ввиду высокой устойчивости к антибиотикам.

 

 

2.6 Культивирование поверхностным методом микроорганизмов Pseudomonas Aeruginosa, Esherichia Coli, Enterococcus Faecealis, Staphilococcus Soprofiticus как тест-объектов при определении антимикробной активности гриба

 

Для культивирования микроорганизмов использовали плотную питательную среду. Культуры Pseudomonas aeruginosa, Esherichia coli, Enterococcus faecealis и Staphilococcus soprofiticus необходимы при определении антимикробной активности в культуральной жидкости и экстракте грибов S. hirsutum и P. Ostreatus.

Состав плотной питательной среды:

1л дистиллированной воды

20г среды ГРМ

Приготовление:

Навеску со средой в количестве, необходимом для приготовления конкретной серии питательной среды, размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение 2 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в стерильные флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин. Среду охлаждают до температуры 45-50°С, разливают в стерильные чашки Петри слоем 4-6 мм. После застывания среды чашки подсушивали, соблюдая правила асептики, в течение 40-60 мин. Готовая питательная среда прозрачная, желтого цвета, рН 7,3±0,2 [3,c.550]. Готовую среду можно использовать в течение 1 месяца при условии хранения ее при температуре 2-8 С.

Совокупность компонентов, входящих в состав среды, соответствующих колоний на поверхности плотной питательной среды, способствовали прорастанию культур: у Pseudomonas aeruginosa наблюдался сплошной рост с образованием сине-зеленого пигмента через 18-20 часов. Esherichia coli – через 16-20 часов вырастали влажные, круглые колонии с ровными краями и гладкой поверхностью, сероватого цвета. Культура Enterococcus faecealis удовлетворив все питательные потребности для роста, вырастали в виде белых круглых и гладких, колонии были полупрозрачные, а появление наблюдалось по истечению 16-20 часов. Staphilococcus soprofiticus проросли как округлые, выпуклые, пигментированные (белые, желтые, золотистые) колонии, а рост наблюдался через 16-20 часов.

Каждый микроорганизм из 4 находился в отдельной пробирке с соблюдением стерильности, так как опыт проводится на чистой культуре. Микроорганизмы Pseudomonas aeruginosa, Esherichia coli, Enterococcus faecealis, Staphilococcus soprofiticus относятся к патогенным или условно-патогенным и представляют опасность для здоровья исследователя и окружающих. Культуру микроорганизмов поддерживали на жидких или твёрдых питательных средах в колбах или пробирках, предохраняя от высыхания и тормозя процессы метаболизма понижением температуры хранения, периодически пересевают на свежую среду.

 

 

2.7 Диско диффузионный метод определения антимикробной активности в гриба Stereum hirsutum

 

Чувствительность микроорганизмов к метаболитам Stereum hirsutum, определяли диско диффузионным методом. Этот метод основан на способности антибиотиков диффундировать из пропитанных ими бумажных или картонных дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганизмов, высеянных на поверхности агаризованной питательной среды. Для исследования антимикробного действия метаболитов S. hirsutum готовили из фильтровальной бумаги диски диаметром 5 мм. Диски автоклавировали и ассептически пропитывали экстрактом тел грибов S. hirsutum, взятых из природы, или культуральной жидкостью, получаемой при глубинном культивировании мицелия данного гриба. Для контрольного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам использовали индикаторные стандартизированные качественные коммерческие диски (НИЦФ, Санкт-Петербург), пропитанные антибиотиками – левомицетин 30 мкг, рифампицин 5 мкг, бензилпенициллин 10 ЕД, офлоксацин 5 мкг. При определении чувствительности ДДМ использовали стандартный инокулюм, соответствующий по плотности 0,5 по стандарту МакФарланда и содержащий примерно 1,5·10  КОЕ/мл, наносили диски с антибиотиками или с метаболитами Stereum hirsutum [33,с. 62]. На одну чашку диаметром 100 мм помещали 4 диска. Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещали в термостат кверху дном и инкубировали при температуре 35°С в течение 18-24 ч (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма). После окончания инкубации чашки помещали кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Радиус зон задержки роста выражали в мм. При измерении зон задержки роста ориентировались на зону полного подавления видимого роста.