Строение клетки, как саморегулируемой системы организма

Экзамен по гистологии (по лекциям Иванова)

Методика взятия, фиксирования и уплотнения материала для гистологического исследования.

1. Взятие материала: секционным (получ в ходе операции); биопсийным (от живого животного, без операции); трупный (берется не позднее 3ч. после смерти при комнатной температуре). Размер 1*1*0,5.

2. Фиксация: цели – убить клетку и сохранить прижизненное состояние. Время от взятия до фиксации не более 1,5 часа (в особых случаях не более 30 мин – железы экзокринной системы).

Физические и химические фиксаторы:

· Физ. – низкие температуры, чтобы быстро заморозить и медленно оттаять.

· Хим. - простые и сложные

Простые (состоят из 1 действующего вещ.). 1. Формалин разводят водопроводной водой 1\3, 1\4. Время от 24 часов при комнат темпер. При пониж темпер - время фиксации удлин, а качество – улучшается. При повышении темпер – время укор, а кач – ухудшается (денатурация белка происходит). Преимущества – доступность, материал сохр длит время, не вызывает сильной деформации тканей и клеток, не раствор жиры. Недостатки – вымывает из клетки углеводы, вызывает у исследователя раздражение слизистых оболочек (формалиновый насморк). 2. Спирт 80-90 ^о , время от 12 часов. Преимущества – доступный, быстрота фиксации, не раствор углеводы. Недостатки – сильно сморщивает клетки, растворяет жиры. 3. Сулеман – содер ртуть, очень хороший фиксатор, ядовитый. 4. Осмиевая кислота – идеальный фиксатор, испол в электрон микроскопии.

Сложные: 1. Спирт-формалин – состоит из равных частей неразведен формалина и спирта 80-96 ^о, дейстует более мягко, чем спирт. 2. Жидкость Карнуа – хлороформ, ледяная уксусная кислота, абсолютный спирт, быстрая фиксация – 4 часа. 3. Жидкость Буэна – содержит пикриновую кислоту.

3. Обезвоживание или Уплотнение – необ сделать ткань прозрачной, производятся в ряде спиртов по возрастанию крепости - 80, 90 и  абсолютного спирта. В каждом спирте, кроме абсолютного, материал дол находиться 1 сутки, в абсолютном не более 3 часов. Материал после абсол спирта переносят в смесь абсол спирта и эфира на 12 ч., потом в чистый эфир 12 ч.

Техника изготовления срезов, их окраска и заключения.

4. Заливка промежуточной среды – должна обладать высокой пластичностью, легко проникать в клетки, не вызывая в них изменения. Используют: эпоксидные смолы (для электронной), целлоидин, парафин.

Материал после абсол спирта переносят в смесь абсол спирта и эфира на 12 ч., потом в чистый эфир 12 ч., далее жидкий раствор целлоидина 1-2 дня; далее густой раствор целлоидина на сутки; далее целлоидин, уплотненный в парах хлороформа, 12 ч; далее бритвой вырезают целлоидиновые блоки, которые хранят в 70^о спирту. 

(помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин на 1-2 ч при 52-56 ^о С. Дают парафину затвердеть; вырезают из него блок с заключённым образцом и закрепляют на деревянном кубике. Также используют заливку в смолы, желатин и замораживание.)

Преимущества – не тратят спец оборудование, не вызывает сильное затвердевание ткани.

Недостатки – невозможно получ тонкие срезы, невоз получ серийных срезов, материал сохраняется недолгое время.

5. Изготовление среза – с помощью микротома, микротомный нож срезает с блока с заключённым образцом тонкой слой органа (срез), парафиновые срезы прикрепляют к предметному стеклу с помощью белка глицерина, высушивают при 37 гр 12 часов.

6. Депрофинирование – стекла со срезами помещ в ксилол на 3-5 мин, далее в спирт 96 на 5 мин, далее всполаскивают дистил водой.

 7. Окраска – с пом гистологич красителей: основные или ядерные (гематоксилин), кислые или цитоплазматические (эозин, оранж), специальные (окрашивают соед ткань, слизь).

Самая распр окраска – гематоксилин-эозин: гематоксилин 1-5 мин, дистил вода, эозин 10 мин, дифферинцируют в 2х порциях спирта по 3-5 мин в каждой, обезвоживают карбол в ксилоле 10-15 сек, просветляют в ксилоле 3-5 мин.

Микроскопируют.

Значение новых методов (цитохимия, гистоавторадиография, люминесцентная и электронная микроскопия) исследования для познания глубинных процессов жизни на клеточном и субклеточном уровнях.

Цитохимия -раздел цитологии, изучающий химический состав клетки и ее компонентов, а также обменные процессы и химические реакции, которые лежат в основе жизнедеятельности клетки. Благодаря развитию методов цитохимии впервые были сформулированы идеи о ведущей роли нуклеиновых к-т в синтезе белка, в развитии организмов и наследственности (Б. В. Кедровский, Т. Касперсон). В 40-х гг. методами цитохимии было доказано постоянство содержания ДНК в хромосомном наборе и определена общебиол. значимость полиплоидных клеток (неск гомологичных наборов хромосом) и выяснена важная роль клеточной полиплоидии в росте и развитии животных и растений. При использовании радиоактивных предшественников синтеза ДНК и РНК определены важные закономерности обновления клеточных популяций и регенерации тканей, изучены закономерности перемещений макромолекул внутри клетки. Цитохим методы используют в медицине для диагностики и прогноза лечения злокачеств опухолей.

Гистоавторадиография – этот метод широко применяют для изучения кинетики клеточных популяций, метаболических процессов в клетках, и определения участков синтеза биополимеров с помощью регистрации веществ, меченых изотопами. Для этого в ткань животного вводят предшественников макромолекулярного соединения (аминокислоты, нуклеотиды), один из атомов которого замещен радиоактивным изотопом. В процессе синтеза белков, гормонов, ферментов в них включается молекула меченого предшественника. Для регистрации места ее включения в темноте на окрашенные срезы наносят специальную фотоэмульсию, после чего проявляют. На участках соприкосновения фотоэмульсии с радиоактивным веществом происходит фотореакция и образуются метки (треки). Этим методом можно определить время перемещения клеток в пластах многослойного эпителия, синтез йодсодержащих гормонов в щитовидной железе.

Люминесцентная микроскопия -основана на том, что многие органические вещества, содержащиеся в клетках, способны светиться при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции смещен в сторону более длинных волн по отношению к излучению, возбуждающему флуоресценцию. Например, хлорофилл зеленых растений в ультрафиолетовых лучах светиться красным светом, а другие вещества – зеленым или желтым. Этот принцип использован на создании люминесцентных микроскопов. Источником света в них служат ксеноновые или ртутные лампы, а объект исследуют через специальные фильтры. Собственной (первичной) флуор-ией обладают пигменты, витамины А, В2 и др вещ. Вызванная (вторичная) фл-ия характерная для катехоламинов (адреналин и норадреналин) мозгового вещества надпочечников, для нее используют специальные вещ. - флуорохромы. Таким образом можно исследовать хим. состав тканевых структур, выявить трофические и секреторные включения в клетках.

Электронная микроскопия -совокупность методов исследования с помощью электронных микроскопов микроструктур тел, их локального состава и локализованных на поверхностях или в микрообъемах тел электрических и магнитных полей. В электронном микроскопе используются лучи с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн (разрешение в 100.000 раз выше, чем в световом микроскопе). Методом ЭМ исследуют ультратонкие срезы, которые готовят на ультратомах. К современным электронно-микроскопическим методам относят ПЭМ (просвечивающую, или трансмиссионную электронную микроскопию)  используется для изучения внутреннего строения клетки. Пучок электронов пропускается через объект, предварительно обработанный тяжелыми металлами, которые накапливаются в определенных структурах, увеличивая их электронную плотность. Электроны рассеиваются на участках клетки с большей электронной плотностью, в результате чего на изображениях эти области выглядят темнее; СЭМ(сканирующую) используется для изучения поверхности объекта.

Строение клетки, как саморегулируемой системы организма.

Клетка - совершенная функционально-структурная организация, в основе которой лежат процессы саморегуляции. Разрушение целостной клеточной структуры ведет к остановке регулирующих механизмов, в основе которых лежит структуры регуляции, обеспечивающие поддержание относительно постоянного состава клетки. Регуляторными механизмами этого процесса являются гены-регуляторы, связанные с ферментами и способные контролировать  качественный состав белков-ферментов и количественный.

Клетки синтезируют АТФ, необходимую организму. Белки-ферменты осуществляют реакции бескислородного и кислородного расщепления глюкозы, в ходе этих реакций выделяется энергия и синтезируется АТФ.

Из окружающей среды клетка получает различные вещества для реакций диссимиляции и  выделяет продукты жизнедеятельности. Эта связь со средой осуществляется с помощью соответствующих структурных образований (поры), через которые проникают и выделяются ионы, вода и мелкие молекулы других веществ. Более крупные частицы твердых веществ, а также капли жидкости проникают в клетку и выделяются из нее путем фаго- и пиноцитоза. Элементы этих обменных процессов, необходимых для поддержания жизнедеятельности клетки, от нормальной работы которой зависит жизнедеятельность более крупных структур многоклеточных организмов.