Люминесцентная микроскопия

Люминесценция, т.е. свечение вещества, возникает в ре­зультате превращения энергии, поглощаемой веществом, в види­мое излучение. Люминесценцией (или флуоресценцией) называют такое явле­ние, когда некоторые вещества под влиянием падающего на них света испускают лучи с другой (обычно большей) длиной волны. Кроме того, вещества, имеющие определенный цвет при обычном освещении, при освещении ультрафиолетовыми лучами приобре­тают совершенно иной цвет. Объект, не видимый в ультрафиоле­товом свете, может приобрести яркий блеск после обработки его флуоресцирующим веществом (флуорохромом). В таком препа­рате люминесцирующие объекты светятся различным цветом в темном поле зрения. Сила их света бывает различной, но чаще всего она невелика, поэтому люминесцентную микроскопию сле­дует проводить в затемненном помещении.

Разница между микроскопией в проходящем свете и флуоресценцией заключается в том, что в последнем случае препарат рассматривается в излучаемом им свете. При этом химический состав клеток и тканей влияет на качество люминесценции и люминесцентная микроскопия в определенной мере является гистохимическим исследованием. Существует пер­вичная и вторичная флуоресценция. При первичной флуоресцен­ции в самом объекте находятся вещества, способные флуоресци­ровать. Вторичная флуоресценция – наведенная, возникает при специальной обработке объекта веществами, способными флуо­ресцировать. Эти вещества называются флуорохромами (акридин оранжевый, флуоресцеин, родамин и др.).

Для люминесцентной микроскопии применяется целый ряд устройств и микроскопов. Основной частью этих устройств является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового света, и система фильтров к нему. В зави­симости от того, используется ли ультрафиолетовый или синий цвет для возбуждения люминесценции, между источником света и объектом помещаются соответствующие фильтры. Так как люми­несценция микроскопического объекта энергетически слабее, чем возбуждающий свет, то она улавливается лишь в том слу­чае, если излишек лучей, идущих от источника света, отсека­ется желто-зеленым фильтром, помещенным на окуляре микро­скопа. Эффект люминесценции наиболее полно выражен в том случае, когда фильтр на окуляре микроскопа полностью отсе­кает лучи, идущие от источника света. При этом при отсут­ствии люминесцирующего препарата получается темное поле зре­ния.

Установка для люминесцентной микроскопии в видимых лучах состоит из яркого источника света и биологического микро­скопа (рис. 7). Между зеркалом микроскопа и источником света устанав­ливается сине-фиолетовый светофильтр (УФС-3, ФС-1 и т. п.). Желтый светофильтр (ЖС-3 или ЖС-18) надевают на окуляр мик­роскопа. С помощью этих светофильтров на препарат падает сине-фиолетовый свет, возбуждающий люминесценцию. Однако этот свет мешает видеть возбуждаемое им свечение препарата и поэтому по пути к глазу наблюдателя отсекается желтым свето­фильтром.

Установку освещения производят по методу Келера, за од­ним исключением: диафрагма конденсора должна быть полностью открыта. Очень важно применение нефлуоресцирующего иммерси­онного масла. С целью гашения собственной флуоресценции к кедровому или другому иммерсионному маслу добавляют на 1 г от 2 до 10 капель нитробензола.

Люминесцентная микроскопия находит широкое применение в микробиологии (рис. 8). Ее преимуществами явля­ются: 1) цветное изображение; 2) высокая степень контрастности самосветящихся объектов на черном фоне; 3) возможность ис­следования как прозрачных, так и непрозрачных живых объек­тов; 4) возможность исследования различных жизненных процес­сов в динамике их развития; 5) обнаружение и установление локализации отдельных микробов и вирусов; 6) развитие тон­чайших методов цито- и гистохимии и экспресс-диагно­стика.