Разделение белковых фракций методом электрофореза (делали на биофизике)

Из курса физической химии известен класс пограничных электрокинетических явлений, свойственных дисперсным системам и капиллярам (рис. 2). М. Smoluchowski (1872 – 1917, Польша) объяснил их (1903) возникновением дзета-потенциала, то есть избытка зарядов двойного электрического слоя на границе раздела адсорбционно связанной = неподвижной и тангенциально смещающейся подвижной = диффузионной фазы. Тот же дзета-потенциал, служит и мерой их интенсивности.

Рис. 2 Схема группировки пограничных процессов

Очевидно, что электрокинетические явления не только широко распространены в биосфере, но их принципы часто применяют в различных областях техники и медицины. Из них, в аналитической и диагностической биохимии чаще всего используют методы центрифугирования и электрофореза, за разработку которых, соответственно, Т. Svedberg (1926) и A.W.K. Tiselius (1948) из университета в Упсале (Швеция), удостоены Нобелевских премий по химии.

Попытки деления смесей частиц с помощью э лектрофореза предпринимали с начала ХХ в. В основу их направленной, катодной или анодной подвижности, легли соответственно, отрицательный или положительный знак и целочисленные величины зарядов. К середине века, аппарат Тизелиуса стал основой электрофореза смесей белков. Он состоял из блока питания постоянного тока, стеклянной камеры с электродами, заполненной буферным раствором и довольно сложной оптики для визуальных наблюдений за делением фракций. Таким образом, вторым фактором деления смесей при свободном электрофорезе в растворе, стали в еличины рН и ионной силы буфера, изменяющие степень ионизации белков. Так, выбор стандартного рН 8,6 буферного раствора для белков сыворотки крови вызван тем, что в этом случае, все их фракции имеют катодную подвижность. К сожалению, приборы этой конструкции, имели ряд неустранимых недостатков, начиная с хрупкости и низкой разрешающей способности и, кончая высокой стоимостью.

В 1950 г. Durrum et al. предложили вести электрофорез белков сыворотки крови на полосках фильтровальной бумаги, пропитанных буфером. Этот тип электрофореза назвали зональным или зонным, т.к. поддержка среды-носителя ограничила диффузию компонентов смеси. Таким образом, свойства зоны, в качестве которой применяют хроматографическую бумагу, ацетилцеллюлозу, водные гели крахмала, агарозы и полиакриламида = ПАГ, стали третьим фактором деления смесей линейных биополимеров. Наконец, замена: стекла на пластиковые камеры разных конструкций и оптических систем прямого наблюдения на сравнительно простые вспомогательные приемы, резко удешевили конструкцию приборов, стандартизовав основные процедуры метода. (рис. 3).

Рис. 3. Результаты зонного электрофореза нормальной сыворотки крови человека. (По http://immunologia.narod.ru/pic20.1.htm).

На электрофореграмме (внизу) и ден-ситограмме (вверху) видны 5 основных полос и пиков, соответствующих сывороточному альбумину = СА и фракциям глобулинов.

Таким образом, любой современный прибор для зонного электрофореза, как минимум включает в себя блок питания постоянного тока, обычно до 500 В и электрофоретическую камеру принципиально разных конструкций, зависящих от свойств зоны и выбора горизонтального, вертикального или других вариантов метода. До сих пор справедливо утверждение, что электрофорез – в основном аналитический метод. Тем не менее, его тонкие модификации, подобные электрофорезу в гелях, изотахофорезу и изоэлектрофокусированию, удается применить и к целям получения препаратов (Скоупс, 1985). Однако автор предупреждал, что пока не освоены простейшие методики зонного электрофореза, начинающим исследователям не стоит и помышлять об этих изощренных процедурах, связанных с множеством трудностей.

Дополнительная литература

1. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. – М.: Наука, 1981. – 286 с.

2. Остерман Л. А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. – М.: Наука, 1983. – 304 с.

3. Скоупс Р. Методы очистки белков. – М.: «Мир». 1985. – 358 с.

4. Троицкий Г. В. Дефектные белки. Постсинтетическая модификация. – Киев.: Наукова думка, 1991. – 232 с.

5. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение. – М.: Мир, 1986. – 398 с.

6. http://www.cultinfo.ru/fulltext/1/001/008/126/016.htm