Иммуноферментный анализ (ИФА)

Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидазы является раствор ортофенилдиамина (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ).

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА (рис.35), непрямой и конкурентные способы (рис.36).

Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре (ИФА – анализаторе).  

В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:

а) конкурентный тип предназначен для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs Ag) в сыворотках и плазме крови при диагностики вирусного гепатита В и определения носительства HBs Ag.

Компоненты:

1) исследуемый материал – сыворотка или плазма крови;

2) антитела к HBs Ag, адсорбированные на поверхности лунки полистиролого микропланшета;

3) конъюгат – мышиные моноклональные антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой;

4) ортофенилендиамин (ОФД) – субстрат;

5) фосфатно – солевой буфер;

6) контрольные сыворотки.

Ход работы:

1. Внесение контрольных и исследуемых сывороток.

2. Инкубация 1 час при 37°С.

3. Отмывание лунок.

4. Внесение конъюгата.

5. Инкубация 1 час при 37°С.

6. Отмывание лунок.

7. Внесение ОФД. При наличии HBs Ag раствор в лунках желтеет.

8. Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых HBs Ag.

Реакция протекает в три фазы:

1. HBs Ag исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ-АТ. (HBs Ag – anti HBs АТ).

2. Антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой связываются с оставшимися свободными детерминантоми HBs Ag комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ (anti HBs АТ - HBs Ag - anti HBs АТ, меченые пероксидазой).

3. ОФД взаимодействуют с пероксидазой комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.

в) непрямой тип является основной тестовой реакцией серодиагностики ВИЧ – инфекции.

Компоненты:

1) исследуемый материал – сыворотка крови (АТ к АГ-м ВИЧ);

2) синтетические пептиды имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: gp 120 и gр 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки;

3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТ к АТ);

4) ОФД;

5) фосфатно-солевой буфер;

6) контрольные сыворотки.

Ход работы:

1. Внесение контрольных и исследуемых сывороток.

2. Инкубация 30 минут при 37°С.

3. Отмывание.

4. Внесение антиглобулиновой сыворотки меченой ферментом.

5. Инкубация 30 минут при 37°С.

6. Отмывание.

7. Внесение ОФД.

Реакция протекает в 3 фазы:

1. Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (gр 120 и gр 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ (АГ ВИЧ - АТ к ВИЧ).

2. Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т.к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки.

3. ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.

Диагностика ВИЧ-инфекции с помощью реакции иммуноблоттинга

Реакция иммуноблотинга (РИ) разработана на основе ИФА. Является самым специфичным и чувствительным методом иммунохимического анализа. Иммуноблотинг (от англ. blot – промокать, пятно) сочетает ИФА с электрофорезом. Применяется для выявления не комплексных антител к ВИЧ, а антитела к отдельным его структурным белкам (белки-р24, гликопротеины: gр120, gр41 и др.). Относятся к экспертным (подтверждающим) реакциям диагностики ВИЧ-инфекции.

Реакция проводится в несколько этапов:

1. Вирус разрушают на компоненты - антигены (р24, gр120, gр 41 и др.), которые подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле, то есть разделению антигенов на фракции по молекулярной массе.

2. Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной и на неё при помощи электрофореза переносятся фракции антигенов. Нитроцеллюлоза ведёт себя подобно промокательной бумаге. Мембрану разрезают на полоски (стрипы). Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов.

3. Стрипы с нанесёнными на него антигенами ВИЧ погружают в сыворотку обследуемого и затем отмывают от несвязавшегося материала.

4. Стрипы инкубируют антиглобулиновой сывороткой, меченой пероксидазой, отмывают.

5. Добавляют субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен), которые соответствуют в зоне локализации комплекса АГ-АТ.

Наличие полос на определённых участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ. Результат иммуноблоттинга считается положительным, если на мембране видны полосы, соответствующие любым двум из трех антигенов ВИЧ — р24, gp41 и gp 120 (рис.37).

    Контрольные вопросы:

1. Иммунологический метод диагностики инфекционных заболеваний.     

2. Экспресс диагностика.

3. Серодиагностика инфекционных заболеваний.  

4. РА на стекле. Назначение. Компоненты. Механизм. Учет реакции.

8. Развернутая реакция агглютинации.  

9. Механизм и практическое использование реакции  РПГА. 

  10.Механизм и диагностическое применение реакции преципитации.

   11. Механизм и диагностическое значение  РСК.

12. РН токсина с антитоксином на мышах.  

13. РН вирусов на мышах. Компоненты. Механизм. Учет реакции.

14.Опсоно-фагоцитарная реакция.

15. Реакция  непрямой иммунофлюоресценции.    

16. ИФА, способы постановки. Механизм. Учет реакции.

17. Реакция иммуноблотинга. Назначение.Компоненты. Механизм.  

Рисунки

Рис. 1. Мазок из E.coli и S.aureus. Окраска по Граму	Рис.2. М.tuberculosis в мазке из мокроты. Окраска по Цилю-Нильсену.
Рис.3. М.leprae в лепрозном бугорке. Окраска по Цилю-Нильсену	Рис.4. С. diphtheriaе, окраска по Нейссеру.

 

Рис.5. Споры В.anthracis.	Рис.6. Капсулы К.рneumoniaе-светлые ореолы вокруг палочковидных бактерий.
Рис. 7. Техника посева на твердую питательную среду.

 

 

 

Рис.8. Посев по Щукевичу.	Рис.9. Колонии микоплазм.
Рис.10. Посев по Дригальскому.	Рис.11 в тексте (см.практич.навыки 3.2).

 

Рис.12. Колониии S. aureus на МПА.	Рис.13. Колонии E. сoli на МПА.
Рис.14. S. аureus, окраска по Граму	Рис.15. E. сoli, окраска по Граму.
Рис.16. Короткий пестрый ряд (рост E. coli)	Рис.17. Короткий пестрый ряд (рост  S. typhi)

 

Рис.18. Среда Китта-Тароцци	Рис.19. Среда Вильсон-Блера
Рис.20. Метод по Отто	Рис.21. Фаго типирование бактерий
Рис.22. Схема ПЦР Рис.23.Определение антибиотикочувствительности бактерий методом бумажных дисков. Рис.24. Бифидобактерии, окраска по Граму                               Рис.25. Среда Эндо. 1.Лактозонегативные колонии. 2.Лактозопозитивные колонии.     Рис.26. Колонии S. aureus на желточно-солевом агаре. Лецитинвителлазная активность (помутнение вокруг колоний). Рис. 27. Реакция агглютинации на предметном стекле. а-агглютинация; б-отсутствие агглютинации   агглютинация                   контроль        контроль сыворотки     антигена Рис. 28. Развернутая РА   Рис. 29. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)   Рис. 30. Реакция кольцепреципитации Рис. 31. Реакция преципитации в геле по Оухтерлони.   Рис. 32. Реакция торможения гемагглютинации    Рис. 33. Реакция связывания комплемента. Рис. 34. Реакция иммунофлюоресценции       Рис. 36. Иммуноферментный анализ (непрямой и конкурентные способы). Рис. 35. Иммуноферментный анализ (твердофазный)   Рис. 37. Результат реакции иммуноблотинга. 1 - 10 - полоски, вдоль которых распределились антигены ВИЧ: p – протеины, gp – гликопротеины.

Список использованной литературы

Основная литература

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов мед. вузов 2-е изд., испр. и доп. - 702 с. Под ред. А.А. Воробьева. М.: МИА, 2012.

 2. Микробиология, вирусология и иммунология: руководство к лабораторным занятиям: учеб.пособие/(В.Б.Сбойчаков и др.); под ред. В.Б.Сбойчакова, М.М.Карапаца. – М.:ГЭОТАР-Медиа, 2014.- 320с.:ил.  

Дополнительная литература

1.Иммунодиагностические реакции: учебное пособие / сост.: Г.К.Давлетшина, З.Г.Габидуллин, А.А.Ахтариева, М.М.Туйгунов, А.К.Булгаков, Т.А.Савченко, Р.Ф. Хуснаризанова, Ю.З.Габидуллин, М.М.Алсынбаев – Уфа: Изд-во ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, 2016. - 86с.

2.Микробиология, вирусология: руководство к практическим занятиям: учебное пособие / Зверев В.В. (и др.); под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.:ГЭОТАР- Медиа, 2015. – 360 с.:ил.

3.Медицинская микробиология и иммунология: Учебник / В.Н.Мальцев, Е.П.Пашков; под ред. В.В. Зверева. – М.: Практическая медицина, 2014. – 512 с.:ил.  

4.Медицинская микробиология [Электронный ресурс] - 4-е изд., стереотип. - Электрон. текстовые дан. - 768 с.- Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785970415306.html В. И. Покровский.. - М.: ГЭОТАР-МЕДИА, 2010.

5. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология [Электронный ресурс]: учебник для мед. вузов - 760 с. - Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Коротяев А.И., Бабичев С.А. СПб.: Спецлит, 2010.

6. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс]: учебник: в 2 т. / Т. 1. - 448 с. - Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Зверев В.В., Бойченко М.Н. М.: Гэотар Медиа, 2010..

7. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс]: учебник: в 2 т. Т. 2. - 480 с. Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Зверев В.В., Бойченко М.Н. М.: Гэотар Медиа, 2010.

8.Медицинская микробиология (вопросы, ответы, схемы) / Под ред.акад.РАМН О.В.Бухарина. М.:Медицина, 2004.

9.Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / Под ред. акад. РАМН

О. В. Бухарина. М.: Медицина; УрО РАН, 2002. ISBN 5-7691-1250-6.