Экспресс-методы диагностики

Иммунохимические исследования. Метод ИФ: тампоном делают два мазка, высушивают их на воздухе и фиксируют на пламени. Один мазок обрабатывают флюоресцирующими противококлюшными антителами, другой - паракоклюшными антителами. Препараты микроскопируют в люминесцентном микроскопе, просматривая не менее 50 полей зрения. О положительном результате свидетельствует обнаружение темных бактериальных клеток с четким светящимся венчиком.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования проводят методом ПЦР.

Серодиагностика. Реакции агглютинации и РСК применяют в основном для ретроспективного подтверждения диагноза и дифференциальной диагностики атипичных форм коклюша. Агглютинины в крови больных появляются на 3-4-й неделе заболевания в титрах 1:20 и выше. В условиях массовой вакцинации детей против коклюша диагностическое значение имеет нарастание титра антител в динамике болезни, поэтому реакцию ставят повторно через 4-5 дней.

Микробиологическая диагностика дифтерии

Материал для исследования: мазки со слизистой оболочки зева и носа, пленки с поверхности миндалин и носоглотки. Материал берут двумя ватными стерильными тампонами, один из которых используют для приготовления мазков, другой - для посева.

Бактериоскопическое исследование (схема 10). Мазки окрашивают по методу Грама, метиленовым синим по Леффлеру, по Нейссеру. Для Corynebacterium diphtheriae характерно наличие полярно расположенных зерен волютина и расположение в виде буквы "V". Corynebacterium pseudodiphtheriae и дифтероиды не имеют зерен волютина или содержат их не на концах, а по длине палочки. Кроме того, сами бактерии располагаются в виде частокола. Применение люминесцентной микроскопии позволяет повысить эффективность исследования.

При этом C.diphtheriae можно отличить от других коринебактерий по коричнево-красному свечению зерен волютина, которое они приобретают после окраски флюорохромом корифосфином. Цитоплазма этих бактерий дает зеленое или желтое свечение. Однако C.diphtheriae часто изменяют свою морфологию, в частности, при санации зева антибиотиками. В настоящее время бактериоскопическое исследование при дифтерии практически не используют в связи с его низкой надежностью (высокой частотой ложноположительных и ложноотрицательных результатов).

Бактериологическое исследование. Является ведущим методом диагностики дифтерии. Материал засевают на кровяной агар и элективные питательные среды, содержащие теллурит: среда Клауберга (питательный агар с теллуритом натрия, глицерином и дефибринированной кровью) и др. На средах с теллуритом задерживается рост кокков и другой микрофлоры зева, что способствует размножению возбудителя дифтерии. На теллуритовой среде C.diphtheriae образует черные колонии за счет восстановления теллурита (биовар gravis формирует колонии серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью

поверхности, напоминающие цветок маргаритки, биовар mitis - круглые выпуклые колонии черного цвета). Типичные колонии, представленные грамположительными палочками булавовидной формы с характерным расположением, содержащими зерна волютина, пересевают на кровяной агар для получения чистой культуры.

Для подтверждения диагноза дифтерии в первую очередь необходимо установить токсигенность выделенной культуры. Наличие токсина определяют с помощью различных серологических реакций. Применяют также метод ПЦР, позволяющий обнаружить присутствие у выделенных бактерий tох -гена, контролирующего синтез дифтерийного токсина. Общепринятым методом определения токсигенности являлась реакция преципитации в агаре с антитоксической противодифтерийной сывороткой. Методы ИФА и ПЦР, разработанные в последние годы, являются более чувствительными и позволяют получить результат в течение 3-5 ч.

Определение токсигенности в реакции преципитации: в чашку Петри с питательным агаром, содержащим 15-20 % лошадиной сыворотки, 0,3 % мальтозы и 0,03 % цистина, кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой, содержащей 5000 АЕ/мл. Чашку подсушивают при 37 °С в течение 30 мин и засевают исследуемые культуры в виде перпендикулярных к бумаге штрихов на расстоянии 0,6-0,8 см от края бумаги. В качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. При размножении токсигенной культуры в месте соединения токсина с антитоксическими антителами в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий - "усов".

Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по морфологическим особенностям, культуральным и биохимическим признакам: пробы на цистиназу, уреазу, ферментация углеводов и др. (табл. 11).

В случае выделения нетоксигенной культуры ставят дополнительную реакцию агглютинации с противодифтерийной сывороткой с целью выявления видоспецифического антигена C.diphtheriae.

Для определения цистиназы (проба Пизу) в столбик питательного агара с цистином уколом засевают исследуемую культуру. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. C.diphtheriae вызывают почернение среды по ходу посева (в результате образования сульфида свинца), вокруг которого появляется зона коричневого цвета, а на глубине 1 см от поверхности агара в среде образуется коричневое "облачко".

Схема 10. Микробиологическое исследование при дифтерии

Таблица 11. Свойства C.diphtheriae и сходных с ней коринебактерий

Условные обозначения: (+) – наличие признака у 85-100 % штаммов; (-) – отсутствие признака; (+ -) – наличие признака у 16-84 % штаммов.

Для определения уреазы (проба Закса) готовят спиртовой раствор мочевины и раствор индикатора - фенолового красного, которые перед употреблением смешивают в соотношении 1:9 и разливают по 1-2 мл в агглютинационные пробирки. Затем исследуемые бактерии петлей вносят и растирают по стенке пробирки. После 20-30-минутной инкубации при 37 °С наблюдают расщепление мочевины уреазой, в результате чего среда приобретает красный цвет.