2020-06-29
198
1. Сущность, методика постановки, учета РА.
2. Современные разновидности РА.
3. Виды и категории иммунитета.
ТЕМА 10 Разновидности реакции преципитации. Реакция связывания комплемента (РСК)
Цель занятия. Разобрать сущность, методику постановки и учета разновидностей реакции преципитации. Разобрать сущность, методику постановки и учета РСК.
Оборудование и материалы. Пробирки, штативы Флоринского, пипетки, физраствор, сыворотки крови, диагностикумы, компоненты для постановки реакции Асколи.
Задание для самостоятельной работы студентов. 1. Поставить и учесть реакцию Асколи, РСК для диагностики бруцеллеза по методике Вассермана.
Рис. 12. Результат раекции Асколи
Таблица 20 – Результат РСК
| Компоненты | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | ||
| Испытуемая сыворотка | ||||||||||
| Антиген, рабочая доза | ||||||||||
| Комплемент, рабочая доза | ||||||||||
| Физраствор | ||||||||||
| Выдерживают 370 С – 30 мин | ||||||||||
| Гемсистема | ||||||||||
| Выдерживают 280 -30 мин
| ||||||||||
| Результат | ||||||||||
Реакция преципитации
Реакция преципитации (осаждения) заключается в осаждении антигена под действием антител. Реакция характеризуется следующими особенностями:
▪высокой чувствительностью и специфичностью;
▪ в реакции используют только растворимый антиген,
т.е. экстракт возбудителя в электролите;
▪ реакцию ставят с концентрированными сыворотками, определяя вид, вариант возбудителя, а также с растворимым антигеном с целью обнаружения в исследуемой сыворотке специфических Ig;
▪ положительный результат оценивают одним знаком плюс.
Реакцию преципитации ставят по типу:
● Кольцепреципитации в пробирках Уленгута методом наслаивания или подслаивания, с использованием равных объемов сыворотки и антигена. Широко применяют реакцию Асколи для выявления антигена возбудителя сибирской язвы в кожевенном сырье, шерсти, патологическом материале, ставят по типу кольцепреципитации, используя стерильный экстракт изучаемого материала. А.Асколи разработал кольцепреципитацию в 1902 году.
Кольцепреципитацию для определения вида крови, мяса, тканей называют реакцией Уленгута.
Положительная кольцепреципитация характеризуется образованием мутного, белого кольца на границе двух жидкостей.
● Флокуляции, когда компоненты (антиген и сыворотку) в пробирке смешивают, в положительных случаях образуется осадок. Широко применяют реакцию флоккуляции по Кану (разработана в 1921 г.) в медицине для обнаружения специфических Ig при третичном и четвертичном сифилисе. С помощью флокуляции можно выявить токсин в исследуемом материале и определить активность антитоксических сывороток. Разновидностью флокуляции является реакция нейтрализации.
|
|
|
●Реакция нейтрализации – эффективный тест для определения типа токсина и активности антитоксических сывороток. Ставят в два этапа. Вначале готовят разведения сывороток, затем смешивают равные объемы экстракта токсина и сывороток, выдерживают в термостате 1-2 часа при 370 С. На втором этапе реакции смесь вводят лабораторным животным (белым мышам, морским свинкам), по 2 животного на смесь каждого разведения сыворотки. Животные, получившие смесь из пробирок, где произошла нейтрализация остаются живыми. Наименьшее количество сыворотки, нейтрализующее действие токсина, принимают за единицу активности (АЕ) антитоксической сыворотки.
● Реакции диффузной преципитации в агаровом геле (РДП), реакции иммунной диффузии (РИД), когда компоненты реакции антиген, сыворотки вносят в лунки агарового геля, выдерживают в течение 48 – 72 часов при комнатной температуре. Положительный результат – серые полосы между лунками с компонентами. Широко применяют РИД для выявления специфических Ig в сыворотке крови крупного рогатого скота при бруцеллезе и лейкозе. РДП применяют для изучения антигенной структуры возбудителей.
● Иммуноэлектрофореза – РДП в электрическом поле, применяют для изучения антигенной структуры возбудителей, ставят на пластинах с агаровым гелем. На месте встречи антигенов и антител образуются серые полосы.
Реакция связывания комплемента
Реакция связывания комплемента (РСК) – сложная двухфазная реакция взаимодействия антигена, антитела и комплемента с выявлением результатов с помощью гемолиза.
В первую фазу взаимодействуют сыворотка обследуемого животного, антиген и комплемент, если в сыворотке содержатся Ig, специфичные антигену, то образуется комплекс, к которому присоединяется комплемент весь или частично. Если сыворотка обследуемого животного не содержит специфических Ig, то комплекс не образуется и комплемент остается свободным.
Во вторую фазу реакции добавляют эритроциты барана и гемолитическую сыворотку (гемсистему), чтобы выявит состояние комплемента. Если комплемент связан полностью, то эритроциты не разрушаются и оседают на дно пробирки – положительный результат - (#); если 80% комплемента связано: в пробирке розовая жидкость, на дне эритроциты – (+++); если в пробирке красная жидкость и осадок из эритроцитов на дне – (++); если комплемент полностью свободен отмечают гемолиз, в пробирке красная прозрачная жидкость – отрицательный результат – (-).
Для постановки РСК необходимы следующие компоненты и посуда: испытуемая сыворотка, антиген, физиологический раствор, градуированные пипетки, пробирки Флоринского, штатив Флоринского, комплемент – лиофильно высушенная сыворотка крови морской свинки, гемолитическая сыворотка, 3%-ная взвесь эртроцитов барана.
Впервые белок сыворотки крови человека, лабораторных животных, вызывающий гемолиз эритроцитов обнаружил Х. Бюхнер и обозначил его как алексин, в 1906 году А.Вассерман уточнил гемолитические и бактериолитические свойства белка и обозначил его как комплемент, установил его высокий титр в сыворотке крови морской свинки. Комплемент для РСК выпускает Щелковский биокомбинат.
Гемолитическую сыворотку выпускают специально для РСК и готовят гипериммунизацией кроликов эритроцитами барана (Армавирская биофабрика).
Постановки реакции предшествует подготовительный период, в котором определяют рабочие дозы компонентов, инактивируют комплемент исследуемых сывороток, прогревая при 540 С в течение 30 мин.
|
|
|
Впервые РСК разработали Ж Борде, О. Жангу в 1901 году, А Вассерман усовершенствовал реакцию для широкого лабораторного исследования с целью выявления сифилисных Ig в сыворотке крови человека.
Постановку главного опыта классической РСК по методике А. Вассермана проводят в восьми пробирках, из которых две опытные и шесть контрольных.
Таблица 21 - Методика постановки главного опыта РСК
| Компоненты | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Испытуемая сыворотка | 0,5 | 0,5 | 0,5 | |||||
| Антиген, рабочая доза | 0,5 | 0,5 | - | 0,5 | ||||
| Комплемент, рабочая доза | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | - | 0,25 | 0,5 | 1,0 |
| Физраствор | - | - | 0,5 | 0,5 | 1,5 | 1,25 | 1,0 | 0,5 |
| Выдерживают 370 С – 30 мин | ||||||||
| Гемсистема | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| Выдерживают 280 30 мин | ||||||||
Учет РСК начинают с контролей, которые оценивают по реакции гемолиза, если контроли сработали, тогда дают оценку РСК в опытных пробирках, положительный результат учитывают в крестах.
РСК ставят с целью:
▪ обнаружения антител у обследуемых животных, используя заведомо известный антиген, широко применяют для серологической диагностики бруцеллеза, листериоза;
▪ определения серотипа или варианта вируса ящура, используя заведомо известные сыворотки.
Если вторую фазу РСК проводят при температуре 5 – 100 С в течение 12 – 16 часов, то тогда ее называют РДСК (реакцией длительного связывания комплемента). РДСК более чувствительна, чем РСК и рекомендована для серологической диагностике бруцеллеза у мелкого рогатого скота.
Методика постановки главного опыта РСК для серологической диагностики бруцеллеза
Главный опыт при массовых исследованиях ставят в двух пробирках, в первую наливают 0,04 мл испытуемой сыворотки и 0,16 мл физраствора, во вторую – 0,6 мл физраствора и проводят инактивирование сывороток при 60 – 620 С – 20 мин. Добавляют в первую пробирку антиген и комплемент по 0,2 мл, выдерживают при 370 С – 20 мин. Затем в первую и во вторую пробирки вносят по 0,4 мл гемсистемы, выдерживают при 370 С в течение 20 мин.
Учет с контрольной пробирки: не должно быть гемолиза, тогда учитывают результат в опытной пробирке. Если получены положительные результаты, сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10.
|
|
|
ТЕМА 11 Патогенные кокки
Цель занятия. Ознакомить студентов с основными свойствами возбудителей стафилококкозов, стрептококкозов, этапами лабораторной диагностики и биопрепаратами.
Оборудование и материалы. Взвеси S.aureus,
St.agalactia, бульонные и агаровые культуры S.aureus, St.agalactia. Мазки St.pneumonia, St.equi. Результаты тестов по определению факторов вирулентности S.aureus: плазмокоагуляция, лецитиназная, гемолитическая активность. Краски и реактивы для окрашивания мазков по Граму.
Задание для самостоятельной работы студентов.
1. Провести бактериоскопию по Граму взвесей S.aureus, St.agalactia, результат зарисовать. 2. Познакомиться с культуральными свойствами S.aureus, St.agalactia, результатами тестов по определению вирулентности S.aureus. 3. Познакомиться с биологическими свойствами патогенных стрептококков, лабораторной диагностикой, биопрепаратами для профилактики и лечения стафилококкозов и стрептококкозов.
Рис. 13. Морфология S.aureus Рис. 14. Морфология St.agalactia
