Подсчет ретикулоцитов крови при анемиях

Ретикулоциты – молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в их цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции (ретикулума), представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии.

Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями. 

Данный метод является наиболее используемым, т.к он простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования,

Принцип метода основан на выявлении зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками (насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте / раствор азура I /раствор азура II) с дальнейшим подсчетом их в мазке крови.
Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.
Подсчет осуществляют с помощью микроскопа: приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом;
в мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии. 

+ простой
+ занимает мало времени
+ более точен
при люминесцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества, однако он возможен только при наличии люминесцентного микроскопа и специальных красителей, в связи с чем доступен лишь немногим лабораториям.

Принцип подсчета основан на способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым.

Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесителе в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски (смесь можно хранить не более 5 часов).
Смесь перемешивают в течение 2 минут, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. При этом жидкость не должна выходить за пределы покровного стекла. 

Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17.
В препарате эритроциты имеют темно-зеленые очертания и не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сетчатая субстанция светится ярко-красным цветом, благодаря чему ретикулоциты легко подсчитать. В крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается. 

Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора.

В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H. Wallace и Joseph R. Culter в 1947 г.

Принцип метода заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов.

Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются. 

Следует обратить внимание на то, что помимо классического параметра ретикулоцитов - относительное (%) содержание ретикулоцитов, определяемого с помощью 1 и 2 методов лабораторной диагностики, в связи с появлением высокотехнологичных гематологических анализаторов (3 метод) стало возможным получать дополнительные информативные ретикулоцитарные параметры:
• ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые;
• ретикулоциты со средним содержанием РНК - фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией);
• ретикулоциты с высоким содержанием РНК - фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией);
• незрелая фракция ретикулоцитов (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction).

Дифференцировка ретикулоцитов, основанная на степени зрелости и, соответственно, содержании нуклеиновых кислот, является отражением гемопоэтической активности костного мозга.

Результаты:

Ретикулоциты обычно крупнее, чем зрелые эритроциты. Цитоплазма ретикулоцитов содержит базофильную сеточку (ретикулум) в виде мелких зерен, отдельных нитей, клубочков и т.п., которая представляет собой агрегированные рибосомы и митохондрии.

По степени зрелости различают 5 видов ретикулоцитов:

· В I группу входят ретикулоциты, имеющие ядро (эритронормобласты). Зернистость у них располагается в виде плотного венчика вокруг ядра.

· Группу II составляют ретикулоциты, имеющие зернисто-сетчатую субстанцию в виде клубка или глыбки.

· К III группе относятся ретикулоциты, имеющие зернистость в виде густой сети.

· В IV группе ретикулоцитов зернисто-сетчатая субстанция имеет вид отдельных нитей.

· В V группу входят ретикулоциты, содержащие отдельные зернышки.

Нормальные значения:

При нормальном эритропоэзе большинство эритроцитов проходит стадию ретикулоцитов в костном мозге. В норме в периферической крови содержится 0,2 – 1% ретикулоцитов.
В норме, по Г. А. Алексееву, почти 80% ретикулоцитов относится к IV – V группам.

Интерпретация результатов:

Ретикулоцитоз отмечается:

· при гемолитических анемиях (число ретикулоцитов может доходить до 60% и более;

· при острых кровопотерях (на 3 – 5 су-тки после кровопотери возникает ретикулоцитарный криз);

· при малярии;

· при полицитемии;

· при лечении железом железодефицитных анемий (через несколько дней (3 - 10) после начала;

· при остром недостатке кислорода;

· при метастазах опухолей в костный мозг.