2020-07-12
134
Кафедра биологии и генетики
УТВЕРЖДЕНО
решением кафедры
«____» ________201 г. протокол № _____
Для студентов I курса лечебного факультета,
обучающихся по направлению подготовки 31.05.01. Лечебное дело
МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ АУДИТОРНОЙ РАБОТЫ
по учебной дисциплине «Биология»
на практическое занятие по теме:
«Цитогенетический и близнецовый метод изучения генетики человека»
Составил: кандидат биол. наук, доцент
Плотникова Наталья Николаевна
Томск – 2019 г.
Форма занятия: практическое.
Учебные цели
Цель занятия: в результате обучения по теме «Цитогенетический и близнецовый методы изучения генетики человека» студенты должны:
1. Знать:
- современные методы приготовления препаратов хромосом человека;
- строение метафазных хромосом;
- классификацию хромосом человека (Денверовская номенклатура);
- роль среды и наследственности в развитии признаков;
- причины многоплодия и методы анализа зиготности близнецов;
- применение цитологического и близнецового методов.
2. Уметь:
- анализировать кариотип человека;
- определять долю наследственности в развитии признака.
3. Владеть:
- навыками кариотипирования;
- основными терминами и понятиями цитогенетики.
План, содержание и расчет времени занятия
| № п/п | Рекомендуемые действия преподавателя | Расчёт времени, мин. |
| 1. | ВВОДНАЯ ЧАСТЬ: изложение структуры занятия, организационные вопросы по работе на занятии. | 5 |
| 2. | ВХОДНОЙ КОНТРОЛЬ ЗНАНИЙ: проверка подготовленности студентов к теме занятия «Цитогенетический и близнецовый метод изучения генетики человека» в форме устного опроса | 15 |
| 3. | ОБСУЖДЕНИЕ УЧЕБНЫХ ВОПРОСОВ: · Цитогенетический метод и его применение в генетике человека. · Строение хромосом. · Приготовление хромосомных препаратов для цитогенетического исследования. · Нормальный хромосомный набор человека при рутинном окрашивании. · Дифференциальное окрашивание хромосом. · Хромосомные болезни, связанные с изменением числа хромосом и структуры хромосом у человека, механизм их развития, примеры. · Близнецовый метод. Значение близнецового метода для понимания соотносительной роли наследственности и среды в развитии признака. · Типы близнецов. · Методы анализа зиготности близнецов. · Конкордантность и дискордантность. · Коэффициент наследуемости. | 40 |
| 4. | ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА НА ЗАНЯТИИ · Доклады с мультимедийными презентациями; · анализ нормального кариотипа человека; · анализ нормального кариотипа человека; · анализ кариотипа человека с анэуплоидией; · решение задач (расчет доли наследственности в развитии признака, % конкордантности и дискордантности близнецов) | 55 |
| 5. | ВЫХОДНОЙ КОНТРОЛЬ ЗНАНИЙ: компьютерное тестирование | 15 |
| 6. | ЗАКЛЮЧЕНИЕ: подведение итогов занятия, оценка работы студентов, задание на следующее занятие | 5 |
| 7. | ИТОГО | 135 |
Учебные материалы
Теоретический материал для подготовки к занятию
Цитогенетический метод исследования хромосом человека. Использование цитогенетического метода позволило выявить группу болезней, связанных либо с изменением числа хромосом, либо с изменениями их структуры. Такие болезни получили название хромосомных. Анализ хромосом человека является диагностическим методом клинической медицины. Хромосомы исследуют в метафазе митоза, когда они приобретают особенности морфологии, допускающие их идентификацию. В зависимости от степени пролиферативной активности клеток разных тканей in vivo и in vitro различают прямые и непрямые методы получения препаратов хромосом. Прямой метод исследования хромосом применяется лишь в том случае, когда доступен источник ткани, обладающий достаточной митотической активностью. У человека к таким тканям относятся костный мозг и лимфатические узлы. Во время эмбрионального развития также отмечается высокая митотическая активность и эмбриональный материал также пригоден для исследования хромосом в метафазе прямым методом. Прямые методы исследования хромосом также широко применяются при цитогенетическом исследовании новообразований. Недостатком прямого метода является то обстоятельство, что не всегда митотический индекс в данной ткани позволяет получить достаточное количество метафаз.
Непрямые методы включают получение препаратов хромосом из любой ткани после ее предварительного культивирования. К началу 60-х годов ХХ столетия был предложен метод получения препаратов хромосом из лейкоцитов периферической крови. Хангерфорд с соавторами разработали метод краткосрочного культивирования клеток периферической крови человека in vitro и предложили применение в качестве митогена (стимулятора клеточного деления) полученный из семян фасоли мукополисахарид фитогемагглютинин (ФГА), позволяющий индуцировать деление Т-лимфоцитов периферической крови. Существует большое количество различных модификаций прямого и непрямого методов приготовления хромосомных препаратов, но основные приемы получения метафазных пластинок остаются неизменными:
1.Использование колхицина, который разрушает веретено деления, для остановки деления на стадии метафазы;
2.Гипотоническая обработка клеток с использованием растворов солей натрия или калия, которые вследствие разницы осмотического давления внутри и снаружи клеток вызывают их набухание и разрыв межхромосомных связей. Такая процедура приводит к отделению хромосом друг от друга, способствуя более сильному их разбросу в метафазных пластинках.
3.Фиксация клеток с использованием жидкости Карнуа (смесь этанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1).
4.Раскапывание суспензии клеток на предметные стекла.
5.Окрашивание хромосомных препаратов.
Номенклатура хромосом человека. В 1960 году в американском городе Денвере была принята первая цитогенетическая номенклатура хромосом человека. В основу классификации была положена их морфологическая характеристика: размер, положение первичной перетяжки – центромеры и наличие других морфологических особенностей - вторичные перетяжки, спутники. Согласно номенклатуре, хромосомы нумеруют от 1 до 23 по мере убывания длины: с 1 по 22 - аутосомы и 23 пары – половые хромосомы. В соответствии с положением центромеры хромосомы делят на метацентрические, субметацентрические и акроцентрические. Важным параметром идентификации является центромерный индекс (ЦИ), который отражает отношение (в %) длины короткого плеча к длине всей хромосомы. 23 пары хромосом человека разбили на 7 групп от A до G
К группе A относят 1-3 хромосомы. Это большие метацентрические и субметацентрические хромосомы, их центромерный индекс от 38-49. Первая пара хромосом – самые большие метацентрические (ЦИ 48-49), в проксимальной части длинного плеча, вблизи центромеры, может быть вторичная перетяжка.
Вторая пара хромосом – самые большие субметацентрические (ЦИ 38-40).
Третья пара хромосом на 20% короче первой, хромосомы субметацентрические (ЦИ 45-46), легко идентифицируются.
Группа B (4 и 5 пары). Это большие субметацентрические хромосомы, ЦИ 24-30. Они не различаются между собой при обычном окрашивании.
Группа C (6-12 пары). Хромосомы среднего размера, субметацентрические, ЦИ 27-35. К этой группе относят и Х-хромосому. В 9-й хромосоме часто обнаруживают вторичную перетяжку. Все хромосомы этой группы можно идентифицировать с помощью Q- и G-окрашивания.
Группа D (13-15 пары). Хромосомы акроцентрические, сильно отличаются от всех других хромосом человека, ЦИ около 15. Все три пары имеют спутники.
Группа E (16-18 пары). Относительно короткие, метацентрические или субметацентрические, ЦИ 26-40 (хромосома 16 имеет ЦИ около 40, хромосома 17- ЦИ 34, хромосома 18 — ЦИ 26). В длинном плече 16-й хромосомы в 10% случаев выявляют вторичную перетяжку.
Группа F (19-20 пары): две короткие, субметацентрические хромосомы, ЦИ 36-46. При обычном окрашивании они выглядят одинаковыми.
Группа G (21-22 пары): это маленькие акроцентрические хромосомы, ЦИ 13-33. К этой группе относят и Y-хромосому. В отличие от 21 и 22 хромосом Y хромосома не имеет спутников, а также отличается большей пикнотичностью и сближенными хроматидами длинного плеча. В середине длинного плеча имеет вторичную перетяжку.
Близнецовый метод. Близнецы – это дети выношенные и рожденные одной матерью одновременно. Близнецовый метод - это исследование генетических закономерностей на близнецах. Основная задача метода определение соотносительной роли наследственности и среды в формировании признака. Монозиготные (идентичные, однояйцовые) близнецы образуются из одной зиготы разделившейся на две (или более) части. Следовательно, с генетической точки зрения они идентичны, то есть обладают одинаковыми генотипами. Они всегда одного пола. Дизиготные (неидентичные, разнояйцовые) образуются путем оплодотворения двух разных яйцеклеток разными сперматозоидами и развиваются в матке одновременно. С генетической точки зрения они сходны между собой как обычные братья и сестры, так как имеют в среднем 50% идентичных генов. Общая частота рождения близнецов составляет примерно 1%.
Близнецовый метод включает в себя три основных этапа:
а) подбор близнецовых пар;
б) определение зиготности близнецов. Для этого чаще всего используется метод полисимптомного сходства – сравнение партнеров пары по внешним морфологическим признакам (пигментация кожи,волос, форма носа, ушей, губ и т.д.). Современная диагностика зиготности основана на анализе наиболее изученных моногенных полиморфных признаков (эритроцитарные и лейкоцитарные антигены, белки сыворотки крови, ощущение вкуса фенилтиокарбомида и т.д.). При этом диагноз зиготности основывается не столько на сходстве, сколько на степени различия, то есть диагноз дизиготности при обнаружении различий между близнецами всегда абсолютен, а диагноз монозиготности всегда вероятностен, потому что обнаруженное сходство может быть и у дизиготных близнецов вследствие случайного совпадения их генетической конституции. Кроме того, для диагностики зиготности могут быть использованы дерматоглифический метод, смешанная культура лимфоцитов, трансплантация кожного лоскута.
в) сопоставление пар и групп моно- и дизиготных близнецов (или партнеров монозиготных пар) по изучаемому признаку является заключительным этапом применения близнецового метода. Методы сравнения выборок близнецов по качественным (дискретным) признакам (ахондроплазия, галактоземия и т. д.) и количественным (рост, вес, продолжительность жизни и т. д.) различны. Какой-либо качественный признак может быть обнаружен у обоих близнецов либо только у одного. В первом случае пара называется конкордантной, во втором – дискордантной (если рассматриваемый признак отсутствует у обоих близнецов, то такая пара вообще не попадает в выборку). При сопоставлении моно- и дизиготных близнецов для каждой из групп определяют степень парной конкордантности, указывающую на долю пар, в которых оба близнеца имеют изучаемые признаки.
В зависимости от характера сбора материала расчеты степени парной конкордантности различаются. При исследовании в популяции всех пар близнецов, имеющих признак, конкордантность количественно определяют, как долю пар близнецов сходных по признаку, выраженную в процентах, среди всех пар близнецов, как сходных, так и различающихся по признаку. Сопоставление конкордантности у моно- и дизиготных близнецов дает приблизительный ответ на вопрос о соотносительной роли наследственности и среды в развитии признака. Принято считать, что конкордантность должна быть значимо выше у моно-, чем у дизиготных близнецов в случае, если наследственные факторы играют доминирующую роль в формировании изучаемых признаков.
Монозиготные близнецы могут быть дискордантны по признаку, в том случае, если на развитие фенотипа оказывают влияние как генетические, так и негенетические факторы. Чем больше влияние среды, тем значительнее будут эти различия и, соответственно, будет уменьшаться разница в парной конкордантности между моно- и дизиготными близнецами. Для вычисления доли наследственности, в развитии признака, используют формулу Хольцингера:
