2020-08-05
85
Чтобы понять, во сколько раз изменяется интенсивность при повышении концентрации ХАФ от нуля до единицы, считали отношение I1/I0, где I1 – интенсивность сигнала при концентрации ХАФ 1нг/мл, а I0 – интенсивность сигнала при отсутсвии ХАФ в растворе. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1. Отношение I1/I0 для различных составов
| Ат-НЧЗ ХАФ-БСА | 100% | 50% | 25% |
| 20:1 | 0,47 | 0,35 | 0,17 |
| 5:1 | 0,42 | 0,28 | 0,05 |
Для разработки количественного метода выбрали два варианта соотношений реагентов – конъюгат ХАФ-БСА 20:1 с конъюгатом АТ-НЧЗ 50% и ХАФ-БСА 5:1 с Ат-НЧЗ 100%. Эти варианты показали cхожие результаты. Критериями выбора служили наибольшая разница между интенсивностями сигналов для концентраций 1 и 0 нг/мл (сотношение I1/I0 должно быть минимальным), но при этом интенсивность сигнала должна быть не менее 20-25 усл.ед., поскольку низкие сигналы могут приводить к увеличению ошибки эксперимента.
Отношения I1/I0 для 25% конъюгатов наночастиц золота с антителами наименьшие, но ввиду низкой интенсивности аналитического сигнала при отсутствии ХАФ в растворе, в дальнейшем для разработки количественного метода эти варианты не рассматривали. Для конъюгата ХАФ-БСА 5:1 и 50% состава Ат-НЧЗ также наблюдалась недостаточно высокая интенсивность сигнала при низких содержаниях ХАФ в аналите. Все эти варианты можно рассмотреть в дальнейшем для разработки качественного теста для определения хлорамфеникола.
Среди оставшихся составов исключили самый первый – ХАФ-БСА 20:1, Ат-НЧЗ 100%, поскольку при концентрации 1 нг/мл ХАФ он имел слишком высокую интенсивность, а отношение I1/I0 велико по отношению с остальными.
Для выбранных вариантов получили градуировочные зависимости в буферном растворе и рассчитали аналитические характеристики (рис. 7, таблица 2).
Рис. 8. Градуировочные зависимости для определения ХАФ в ФБСТ
Таблица 2. Аналитические характеристика метода ИХА хлорамфеникола
| Состав реагентов | Предел обнаружения, нг/мл (N=10) | Предел определения, нг/мл (N=10) | Относительное стандартное отклонение, % (N=5) |
| ХАФ-БСА 20:1 Ат-НЧЗ - 50% | 0,039 | 0,064 | 3,5-8,1 |
| ХАФ-БСА 5:1 Ат-НЧЗ - 100% | 0,035 | 0,059 | 3,7-9,2 |
Таким образом, была разработана тест-ситема для количественного определения ХАФ в буферном растворе методом ИХА, предел обнаружения которой сравним с литературными данными [17, 42, 43] и позволяет определять остаточные количества ХАФ ниже установленного критерия MRPL (0,3 нг/мл), даже при разбавлении образцов молока. Пределы обнаружения при визуальной регистрации составил порядка 2-3 нг/мл. Метод харатеризуется хорошей воспроизводимостью результатов анализа, относительное стандартное отклонение для стандартных растворов ХАФ не превышало 10%. Оба варианта показали схожие аналитические характеристики, при выборе конечного состава руководствовались экономическими факторами: для состава ХАФ-БСА 20:1, 50% требуется в два раза меньше антител, из-за чего стоимость тест-ситемы будет ниже.
