Химические реагенты и биологические препараты

В работе использовали следующие реагенты: золотохлористоводородную кислоту (ЗХВК), Твин 20 («Fluka», Швейцария); хлорамфеникол, сукцинат хлорамфеникола, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид хлорид, N–гидроксисукцинимид, бычий сывороточный альбумин (БСА), цитрат натрия («Sigma», США); диметилформамид (ДМФА), карбонат, азид, хлорид натрия; одно- и двузамещенные фосфаты калия, сахарозу («Химмед», Россия), поликлональные антитела к ХАФ, белок А стафилококка (ЗАО «НВО Иммунотех», Россия).

В мультимембранных тест-полосках для иммунохроматографии использовали следующие мембраны:

·  аналитические нитроцеллюлозные мембраны – CNPC (размер пор 15 µ) (MDI, Индия);

·  мембраны для нанесения конъюгата – РТ-5 (MDI, Индия));

·  мембраны для нанесения образца – GFB-R7L, GFB-R4, (MDI, Индия), MAPDS-0300 (Arista Biologicals, США);

·  абсорбирующая мембрана – АР045 (MDI, Индия).

Образцы молока были взяты из торговой сети.

Оборудование

Измерение рН проводили на рН-метре фирмы «Mettler-Toledo» (Швейцария) с точностью до 0,02 ед. рН, измерение рН растворов коллоидного золота проводили с использованием рН-полосок фирмы Fisher (США) с диапазоном определения рН от 5 до 9 единиц.

Навески реагентов взвешивали на электронных весах «Mettler-Toledo» (Швейцария) с точностью до 0,1 мг.

Измерения оптического поглощения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-1202 («Shimadzu», Япония).

Нанесение конъюгатов ХАФ с БСА на мембрану производили при помощи автоматического диспенсера бесконтактного типа BioDot XYZ 3050 (BioJet Quanti 3000, BioDot, США).

Для резки тест-полосок использовали резак гильотинового типа Index Cutter-I, (A-Point Technologies, США).

Центрифугирование производили, используя Eppendorf 5810R (Eppendorf, Германия).

Для количественного определения интенсивности окраски аналитической и контрольных зон тест-полоски использовали сканер Epson Perfection V700 Photo (Seiko-Epson, Япония) с разрешением 600 точек на дюйм в 24-битном цвете (RGB). Анализ полученных цифровых изображений (в формате.tif) проводили с использованием программы Scion Image.

Размер частиц золота и золотых нанооболочек определяли на кафедре криоэлектроники Физического факультета МГУ на сканирующем электронном микроскопе фирмы Carl Zeiss (Германия).

Приготовление растворов

Все растворы готовили на деионизованной воде Milli-Q («Millipore», Франция).

Использовали следующие буферные растворы:

·  0,01 М К-фосфатный, рН=7,4 (ФБ);

·  0,01 М К-фосфатный, 0,15 М NaCl, рН=7,4 (ФБС);

·  0,01 М К-фосфатный, 0,15 М NaCl, 0,1% твин 20, рН=7,4 (ФБСТ).

Стандартные растворы ХАФ для анализа с концентрациями 0; 0,1; 0,3; 1; 3; 10 нг/мл готовили в ФБСТ или молоке из исходного раствора ХАФ (1000 нг/мл в ФБС).

Рабочие растворы конъюгатов ХАФ-БСА и белка А с выбранными концентрациями готовили в ФБС.

Методы исследований

Получение конъюгатов сукцината ХАФ с БСА (ХАФ-БСА)

4 мг сукцината ХАФ растворяли в 100 мкл ДМФА. При перемешивании к полученному раствору добавляли 200 мкл раствора 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид хлорида (EDCl, 5 мг) и 100 мкл раствора N–гидроксисукцинимида (3 мг). Реакционную смесь инкубировали 30 минут при комнатной температуре.

Затем активированное производное сукцината ХАФ добавляли к 1 мл раствора БСА (10 мг/мл в ФБС; 0,145 мкмоль) из расчёта 2,9 мкмоль (129 мкл) и 0,725 мкмоль (32 мкл). Перемешивали 1 час при комнатной температуре и оставляли на ночь при температуре 4˚С. Полученные растворы конъюгатов ХАФ-БСА диализовали дважды против 2 л ФБС.

Получение наночастиц золота

Наночастицы золота получали по методу Френса [27]. К 200 мл кипящего 0,01%-го раствора золотохлористоводородной кислоты добавляли при перемешивании 4,2 мл 1% -го водного раствора цитрата натрия. После этого полученный раствор кипятили еще 15 минут. Раствор охлаждали в тёмном месте и измеряли спектр поглощения в диапазоне длины волны 400-600 нм.

Получение конъюгата наночастиц золота с антителами

К 1 мл раствора коллоидного золота с pH 7,0-7,5 (10 мкл/мл 0,1 М раствора Na₂CO₃) добавляли по каплям 100 мкл раствора антител (0,22 мг/мл в деионизованной воде), перемешивали 30 минут при комнатной температуре. После чего добавляли 20% раствор БСА до конечной концентрации 0,2%, выдерживали 20 минут при комнатной температуре, затем вводили 50% раствор сахарозы (до 10%) и азид натрия (до 0,01%) и хранили при температуре +4˚С.

Для удаления несвязавшихся антител конъюгат центрифугировали (30 мин, 11000g, 4˚С). Супернатант удаляли, осадок перерастворяли в требуемом объеме ФБ, содержащего 0,1% БСА, 10% сахарозы и 0,01% азида натрия. Полученный раствор наносили на полоску стекловолоконной мембраны 4×4 мм из расчета 5 мкл на полоску.

Изготовление иммунохроматографической тест-полоски

На аналитическую нитроцеллюлозную мембрану CNPC(15µ) наносили раствор конъюгата ХАФ-БСА в выбранной концентрации в ФБС с помощью программируемого автоматического диспенсера BioDot XYZ 3050 (BioJet Quanti 3000, BioDot, США) для формирования аналитической зоны. Для формирования контрольной зоны иммунохроматографической системы на расстоянии 5 мм от аналитической наносили раствор белка А с концентрацией 1 мг/мл в ФБС. Использовали следующие параметры насоса BioJet Quanti 3000 для нанесения образцов: размер капли – 30 нл, шаг – 0,3 мм, скорость – 50 мм/сек. Полоски высушивали при температуре 37˚С (относительная влажность 25-30%) в течение 24 ч и хранили при комнатной температуре в герметично закрытой упаковке.

Растворы конъюгатов антител с наночастицами коллоидного золота наносили на мембраны РТ-5 и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Собирали тест-полоски в соответствии со схемой на рис. 1.