Получение иммунореагентов

Первоочередная задача в ходе разработки метода ИХА для определения ХАФ состояла в получении иммунохимических реагентов. Для иммобилизации в тестовой зоне синтезировали конъюгаты сукцината ХАФ с БСА (в соотношении 20:1 и 5:1) по методу активированных эфиров (с использованием водорастворимого карбодиимида и N-гидроксисукцинимида). Метод включает в себя активацию карбоксильной группы сукцината ХАФ путем образования N-гидроксисукцинимидного эфира и взаимодействия последнего с аминогруппой лизина белка с образованием пептидной связи (рис. 5).

Рис. 5. Схема синтеза конъюгата ХАФ-БСА

Выбор данного метода синтеза конъюгатов обусловлен тем, что, по сравнению с использованием одного карбодиимида, он дает меньше побочных продуктов и обеспечивает более высокий выход продукта за счет формирования лучшей уходящей группы и более стабильного промежуточного продукта. Для иммобилизации использовали концентрацию полученных конъюгатов 0,5 мг/мл в ФБС.

Раствор коллоидного золота получали путем восстановления золотохлористоводородной кислоты цитратом натрия по методу Френса [27]. Наночастицы золота, полученные в данной работе, по данным электронной сканирующей микроскопии, имели средний размер 21 нм и пик поглощения 521 нм (рис. 6).

Рис. 6. Спектр наночастиц золота

С этими НЧЗ получали конъюгаты со специфическими антителами. Сорбция антител на поверхности наночастиц способствует их стабилизации, препятствуя их коагуляции. При этом антитела сохраняют свою способность связываться с антигеном. Ранее были подобраны оптимальные условия сорбции антител, при которых НЧЗ стабильны при увеличении ионной силы раствора: рН 7,0-7,5, концентрация 20 мкг/мл золя.

К чувствительности определения остаточных количеств ХАФ в продуктах питания предъявляются высокие требования. Уменьшение концентраций специфических иммунореагентов часто приводит к увеличению чувствительности в конкурентных схемах анализа. С этой целью получили 3 конъюгата НЧЗ с антителами, где специфические к ХАФ антитела составляли 100%, 50% и 25% от общего количества антител. Для сохранения необходимой для стабилизации НЧЗ концентрации белка использовали "балластные" (не связывающие ХАФ) антитела. Предполагалось, что это может влиять на эффективность конкуренции связывания меченых золотом антител как свободного ХАФ в определяемой пробе, так и сорбированного в составе конъюгата с БСА в тестовой зоне.