Антимикробное действие антибиотиков

Структурная организация бактериальной клетки

 

Клетка прокариот, несмотря на относительно малые размеры, имеет все основные структурные компоненты, необходимые для осуществления обмена веществ (рис. 7). Как и всякая другая, прокариотическая клетка имеет цитоплазму, которая окружена цитоплазматической мембраной. Цитоплазма вместе с цитоплазматической мембраной составляют протопласт, снаружи от него расположены поверхностные структуры. К их числу относятся клеточная стенка, капсулы, чехлы, слизистые слои, жгутики, ворсинки и т.д.

 

Клеточная стенка

Клеточная стенка является обязательным структурным элементом бактериальной клетки, исключение составляют микоплазмы и L-формы. На долю клеточной стенки приходится от 5 до 50% сухих веществ клетки.

По строению и химическому составу клеточная стенка прокариот отличается от таковой эукариотических организмов. Основным компонентом клеточной стенки большинства бактерий является муреин, относящийся к классу пептидогликанов. Муреин – гетерополимер, построенный из цепочек, в которых чередуются остатки N-ацетил-глюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенные между собой β-1,4-гликозидными связями (рис. 8).

Такие неразветвленные гетерополимерные цепи образуют основу муреина. Остатки N-ацетилмурамовой кислоты через лактильные группы соединены пептидной связью с аминокислотами. К типичным аминокислотам, обнаруженным в составе муреина, относятся: L-аланин, D-глутаминовая кислота, мезо-диаминопимелиновая кислота и D-аланин.

Диаминопимелиновая кислота относится к диаминокислотам и находится в муреине в мезо-форме: рисунок

У некоторых бактерий вместо мезо-диаминопимелиновой кислоты встречаются L-лизин; либо L- или  D-орнитин; либо 2,4-диаминомасляная кислота, либо гомосерин, либо гидроксилизин.

Мезо-диаминопимелиновая кислота, L-лизин или другие диаминокислоты играют большую роль в межмолекулярных сшивках, так как в образовании пептидных связей могут принимать участие обе аминогруппы и, таким образом, связываются две гетерополимерные цепи муреина между собой (рис. 9).

Благодаря пептидным связям гетерополимерные цепи связаны между собой и образуют мешкообразную гигантскую молекулу – муреиновый мешок, который выполняет функцию опорного каркаса клеточной стенки (рис. 10).

Следует отметить, что особенностью клеточных стенок бактерий

по сравнению с клетками эукариот является наличие в них особых структурных элементов:

- чередующихся последовательностей N-ацетилглюказамина и N-ацетилмурамовой кислоты;

- наличие мезо-диаминопимелиновой кислоты; D-форм аланина и глутаминовой кислоты.

Эти структурные элементы составляют ахиллесову пяту бактерий, используемую врачами в борьбе с инфекцией. Для борьбы с инфекцией бактериальной этиологии применяют лекарственные препараты, специфически воздействующие только на клеточные стенки бактерий или на процесс их синтеза, но не на клетки растений, животных и человека.

Химический состав и строение клеточной стенки постоянны для определенного вида бактерий и являются важным диагностическим признаком, который используется для идентификации бактерий. В зависимости от строения клеточной стенки бактерии делятся на две большие группы: грамположительные и грамотрицательные. Существует метод окраски, позволяющий разделить бактерии на эти две группы. Он был предложен в 1884 году датским ученым Х. Грамом. Этот метод основан на различной способности микроорганизмов удерживать в клетке красители трифенилметанового ряда – кристаллический фиолетовый и генциановый фиолетовый, что в свою очередь зависит от химического состава и ультраструктуры клеточной стенки бактерий.

Клеточная стенка грамположительных бактерий под электронным микроскопом выглядит как гомогенный плотный слой, толщина которого колеблется для разных видов от 20 до 80 нм (рис. 11). Муреин в клеточной стенке грамположительных бактерий составляет от 50 до 90% ее сухой массы. С муреином связаны тейхоевые кислоты – полимеры, образованные остатками спирта рибита или глицерина, связанными фосфодиэфирными мостиками. Тейхоевые кислоты влияют на катионный обмен клетки. Считается, что они осуществляют захват из окружающей среды и связывание ионов Mg^2+. У некоторых бактерий они принимают участие в регуляции активности аутолитических ферментов – гидролаз, способных разрушать собственную клеточную стенку в процессе роста. Помимо пептидогликана муреина и тейховых кислот в составе клеточной стенки грамположительных бактерий в небольшом количестве обнаружены полисахариды, белки и липиды (табл. 3). Клеточная стенка у грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, т.е. периплазматического пространства между клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной нет. Кроме того у грамположительных бактерий нет внешней или наружной мембраны.

К грамположительным бактериям относятся следующие: Bacillus subtilis, Sarcina ventriculi, Streptococcus lactis, Staphyloccocus aureus, Clostridium tetani, Clostridium perfringens и др. (рис. 12).

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий многослойна, толщина ее составляет от 14 до 17 нм (рис. 13). Внутренний слой клеточной стенки представлен пептидогликаном муреином, на долю которого приходится от 1 до 10% ее сухой массы. Структурные микрофибриллы пептидогликана грамотрицательных бактерий сшиты менее компактно, поэтому поры в их пептидогликановом слое значительно шире, чем в молекулярном каркасе грамположительных бактерий. Внешний слой клеточной стенки (наружная или внешняя мембрана) образован фосфолипидами, липопротеинами и белками. По строению наружная мембрана имеет типичную организацию, характерную для элементарных мембран. Основной фракцией наружной мембраны являются липиды, составляющие в среднем 22% сухой массы клеточной стенки. Наружная мембрана выполняет не только механические, но и важные физиологические функции. В ней находятся трансмембранные белки, которые насквозь пронизывают мембрану. Они представляют собой заполненные водой каналы или гидрофильные поры в липофильной мембране, их называют поринами. Существует несколько различных типов поринов. Они осуществляют транспорт через мембрану гидрофильных низкомолекулярных веществ. Одной из отличительных особенностей грамотрицательных бактерий является отсутствие в их клеточной стенке тейхоевых кислот.

Компоненты клеточной стенки у грамотрицательных бактерий разделены электронно-прозрачным слоем, а также четко отделены от цитоплазматической мембраны. Пространство между цитоплазматической и наружной мембраной получило название периплазматического. В периплазматическом пространстве находятся белки, такие как протеиназы, нуклеазы, периферические белки цитоплазматической мембраны, рестриктазы и, так называемые, связующие белки, которые участвуют в переносе некоторых субстратов в цитоплазму – пермеазы.

К грамотрицательным бактериям относятся: Escherichia coli, Erwinia carotovora, Proteus vulgaris, Yersinia pestis, Pseudomonas aeruginosa и др. (рис. 14).

Клеточная стенка бактерий выполняет следующие функции:

- механически защищает клетку от воздействий факторов окружающей среды;

- обеспечивает поддержание формы бактериальной клетки;

- дает возможность клетке существовать в гипотонических растворах;

- осуществляет транспорт веществ и ионов (характерно для грамотрицательных бактерий, имеющих наружную мембрану, которая является дополнительным барьером для их поступления; основной барьер – цитоплазматическая мембрана);

- препятствует  проникновению в клетку токсических веществ (также более характерно для грамотрицательных бактерий, имеющих наружную мембрану);

- на клеточной стенке находятся рецепторы, на которых адсорбируются бактериофаги и бактериоцины;

 - в клеточной стенке  находятся антигены (липополисахариды у грамотрицательных бактерий и тейховые кислоты у грамположительных бактерий);

- на клеточной стенке находятся рецепторы, ответственные за взаимодействие клеток донора и реципиента при конъюгации бактерий.

Вместе с тем, следует отметить, что клеточная стенка не является жизненно важной структурой, так как в определенных условиях она может быть удалена и бактериальные клетки при этом существуют в виде протопластов или сферопластов.

Протопластами называют клетки округлой формы, полностью лишенные остатков клеточной стенки и окруженные только цитоплазматической мембраной. Их образование характерно чаще для грамположительных бактерий. Сферопласты отличаются от протопластов тем, что у них сохраняются остатки клеточной стенки, а образуются они преимущественно из клеток грамотрицательных бактерий. 

Протопласты и сферопласты можно получить в лабораторных условиях, обрабатывая клетки бактерий лизоцимом (или иначе N-ацетилмурамидаза), разрушающим муреин, антибиотиками пенициллинового ряда (пенициллин, ампициллин, карбенициллин и др.) или циклосерином, подавляющими синтез муреина. Фермент лизоцим действует на β-1,4-гликозидные связи муреина и тем самым разрушает муреин у бактерий со сформировавшейся клеточной стенкой. Антибиотики пенициллинового ряда и циклосерин оказывают действие

только на растущие бактерии, нарушая процесс синтеза муреина клеточной стенки, а именно, они препятствуют поперечной сшивке пептидогликановых цепей, т.е. образованию пептидных связей. Протопласты и сферопласты можно получить и с помощью других ферментов, которые разрушают пептидные связи, участвующие в поперечной сшивке гетерополимерных цепей муреина. В качестве примера можно привести фермент эндопептидазу, синтезируемый бактериями Escherichia coli. Этот фермент разрывает пептидную связь между D-аланином и мезо-диаминопимелиновой кислотой.

Протопласты и сферопласты стабильно сохраняются в гипертонических или изотонических условиях. Для создания гипертонических условий чаще всего используют сахарозу и маннит в концентрациях 0,1 – 1,0 М. В гипотонических условиях протопласты и сферопласты лопаются и образуют

«тени».

Протопласты и сферопласты в 3 – 10 раз крупнее исходных клеток бактерий. В гипертонических или изотонических условиях они осуществляют обмен веществ, характерный для исходных клеток, т.е. онисохраняют дыхательную активность, синтезируют необходимые биополимеры, образуют эндоспоры, если процесс споруляции уже был инициирован. Можно наблюдать рост сферопластов и протопластов, а иногда и деление. В отличие от исходных клеток на них не адсорбируются бактериофаги и бактериоцины. Кроме того у протопластов и сферопластов отсутствуют мезосомы – производные цитоплазматической мембраны. 

При снятии действующего на образование муреина фактора (пенициллин, циклосерин, лизоцим и др.) протопласты, как правило, отмирают, реже регенерируют клеточную стенку и возвращаются в исходное состояние, но могут превращаться в L-формы. Сферопласты ревертируют (превращаются) в нормальные бактериальные клетки, либо превращаются в L-формы, либо отмирают.

L-формами принято называть бактерии, частично или полностью лишенные клеточной стенки, но сохранившие способность к развитию. Буква L – первая буква названия Листеровского института в Лондоне, где впервые обратили внимание на развитие морфологически весьма необычных клеток в культуре бактерий Streptococcus moniliformis, выделенной из жидкости уха крысы. Позже были описаны L-формы у самых разных видов бактерий. Было показано, что L-формы возникают спонтанно или индуцировано – под воздействием агентов, блокирующих синтез клеточной стенки (антибиотиков пенициллинового ряда и циклосерина, ультрафиолетовых и рентгеновских лучей, аминокислоты глицина).

L-формы образуются в результате несбалансированного роста нормальных бактериальных клеток в длину и в толщину и поэтому полиморфны. В культурах L-форм обнаруживаются клетки размером 0,2 – 50 мкм. Они шаровидные, нитевидные, присутствуют также и бесструктурные массы. L-формы проходят через бактериальные фильтры и легко разрушаются при механических воздействиях. В отличие от протопластов и сферопластов клетки L-форм имеют хорошо развитую систему внутрицитоплазматических мембран, т.е. у них имеются мезосомы. В отличие от нормальных клеток L-формы часто содержат крупные вакуоли. L-формы обладают пониженным уровнем метаболической активности, чем исходные бактерии. Они нечувствительны к действию любых агентов, влияющих на клеточную стенку. Культивировать L-формы можно только на специальных средах с высоким осмотическим давлением. L-формы лучше растут на плотной, чем в жидкой среде. На плотной среде они образуют колонии, врастающие  в агар и имеющие характерную форму перевернутой шляпы. Колонии растут медленно, хотя иногда достигают значительных размеров. У L-форм не функционируют нормальные механизмы клеточного деления. В основном они делятся с образованием элементарных тел, которые отпочковываются от поверхности клетки или от мембраны вакуоли.

Различают стабильные и нестабильные L-формы. Нестабильные L-формы обладают элементами клеточной стенки и поэтому способны ревертировать в нормальные бактериальные клетки после исключения действия фактора, вызвавшего их образование. Стабильные L-формы полностью лишены ригидной клеточной стенки, что сближает их с протопластами. Они крайне редко ревертируют в исходные бактериальные формы и существуют без изменений в различных условиях среды. Переход в L-форму можно рассматривать как способ переживания бактериями неблагоприятных условий, особенно в случаях патогенных микроорганизмов.

Исследования L-форм представляют существенный интерес для медицинской микробиологии, поскольку в этой форме в организме человека и животных могут сохраняться патогенные бактерии. При нерациональном использовании антибиотиков, приводящем к образованию L-форм из бактерий, может наступить улучшение состояния больного. Однако после прекращения приема лечебного препарата наступает превращение L-форм в бактерии исходного вида с восстановлением их вирулентности, что приводит к рецидиву болезни. Бактерии, у которых отсутствует клеточная стенка, существуют и в природе: это микоплазмы. Первым описанным представителем микоплазм явился возбудитель плевропневмонии крупного рогатого скота. Подобные микроорганизмы обнаружены и у других животных – овец, коз, крыс, собак, а также у человека, всем им было дано общее название РРLО (плевропневмониеподобные организмы). В настоящее время показано, что микоплазмы могут существовать как сапрофиты в естественных условиях, а также вызывать заболевания и у растений.

Антимикробное действие антибиотиков

Антибиотики (антибиотические вещества) – низкомолекулярные продукты метаболизма микроорганизмов, растений и животных или их модификации, задерживающие рост или полностью подавляющие развитие других микроорганизмов. Большинство известных в настоящее время антибиотиков образуются именно клетками микроорганизмов.

Первый антибиотик был открыт шотландским бактериологом А.Флемингом в 1929 году. Флеминг А. выделил плесневый гриб, который был определен как Penicillium notatum, и установил, что культуральная жидкость этой плесени способна оказывать антибактериальное действие по отношению к патогенным коккам. Культуральная жидкость гриба, содержащая антибактериальное вещество, названа А.Флемингом пенициллином. Хотя попытки А.Флеминга выделить активное начало, образуемое грибом P.notatum не увенчались успехом, но большой его заслугой является то, что он указал на перспективы практического применения обнаруженного им агента.

Спустя примерно десять лет после сообщения А.Флеминга пенициллин начал изучать Э.Чейн. Он был  убежден, что это вещество –фермент. В 1940 году Х.Флори и Э.Чейн получили в кристаллическом виде пенициллин и установили, что это не фермент, а низкомолекулярное вещество пептидной природы.

Изучение пенициллина в бывшем Советском Союзе было начато З.В.Ермольевой. В 1942 году под ее руководством в лаборатории биохимии микробов Всесоюзного института экспериментальной медицины в Москве был получен первый отечественный антибиотик, сходный с пенициллином, – крустозин, сыгравший огромную роль в спасении жизней воинов в годы Великой Отечественной войны.

После того как было установлено, что пенициллин обладает активностью в отношении возбудителей  септических инфекций, пневмонии, эпидемического менингита и других заболеваний, начались интенсивные поиски продуцентов этого антибиотика. В результате было установлено, что пенициллин могут синтезировать не только Penicillium notatum, но и многие другие виды грибов, например, P.chrysogenum, P.nigricans, Aspergillus flavus, A.nidulans.

Пенициллины, синтезируемые различными микроорганизмами, близки по химическому строению. Они относятся к группе β-лактамных антибиотиков, общим для которых является наличие 4-х членного β-лактамного кольца, входящего в состав 6-аминопенициллановой кислоты. К 6-аминопенициллановой кислоте присоединен радикал. В зависимости от того, какой радикал присоединен к 6-аминопенициллановой кислоте, все антибиотики пенициллинового ряда разделяют на природные и полусинтетические. В качестве примера рассмотрим строение бензилпенициллина или пенициллина G:

рис

Исходным продуктом для получения полусинтетических пенициллинов является 6-аминопенициллановая кислота, которую чаще всего получают путем расщепления природных пенициллинов ферментом пенициллинацилазой, синтезируемым многими микроорганизмами:

Рис

Затем к 6-аминопенициллановой кислоте химическим путем присоединяют различные радикалы. Примером полусинтетических антибиотиков пенициллинового ряда являются: 

рис

Полусинтетические антибиотики в отличие от природных хороши тем, что они не инактивируются β-лактамазами, которые в молекулах природных антибиотиков расщепляют β-лактамное кольцо. Поскольку этот фермент синтезируется многими микроорганизмами и они устойчивы к природным пенициллинам, то лечить заболевания, возбудителями которых являются такие микроорганизмы, ими нельзя. Прибегают в данном случае к полусинтетическим антибиотикам.

К настоящему времени выделено и описано более 3000 антибиотиков. Примерно 50% известных антибиотиков синтезируются штаммами, принадлежащими к актиномицетам, причем главным образом к одному из родов – роду Streptomyces. Большое число антибиотиков являются продуктами жизнедеятельности других бактерий, но среди этих антибиотиков лишь немногие нашли пока практическое применение. Почти все антибиотики бактериального происхождения по химической природе являются пептидными. Среди бактерий следует выделить спорообразующие бактерии Bacillus subtilis, которые способны образовывать около 70 различных полипептидных антибиотиков, Bacillus polymyxa – 20 антибиотиков, которые относятся к семейству полимиксиновых, Bacillus brevis – 23 антибиотика. Антибиотики продуцируются также многими видами плесневых грибов. Способность к синтезу антибиотиков не является строго специфическим признаком. Один и тот же антибиотик может образовываться микроорганизмами, относящимися к разным видам, родам и даже порядкам. С другой стороны, штаммы, относящиеся к одному виду, могут синтезировать разные антибиотики. Однако, как правило, чем дальше отстоят друг от друга организмы в таксономическом отношении, тем меньше вероятность, что они синтезируют один и тот же тип антибиотика.

Антибиотики в химическом отношении представляют очень гетерогенную группу соединений:

- молекулярная масса антибиотиков варьирует от 150 до 5000 дальтон, т.е. это низкомолекулярные вещества;

- молекулы одних антибиотиков состоят или только из атомов С и Н, но чаще из С, О, Н и N; другие антибиотики содержат также атомы серы, фосфора и галогенов;

- в молекулах антибиотиков представлены почти все функциональные группы, известные в органической химии (гидроксильная, карбоксильная, карбонильная, азотсодержащие функциональные группы и т.д.), а также алифатические и алициклические цепи, ароматические кольца и т.д.

Общим для всех антибиотиков является то, что они могут быть получены в кристаллическом виде. Отличие антибиотиков от других продуктов метаболизма микроорганизмов, также подавляющих рост отдельных видов, как, например, спирты, органические кислоты, перекиси состоит в следующем:

- во-первых, антибиотики обладают высокой биологической активностью. Например, для подавления роста грамположительных бактерий (стрептококков, микрококков и др.) требуется концентрация антибиотика эритромицина, равная всего 0,01 – 0,25 мкг/мл. Конечно, при таких ничтожно малых концентрациях спирта или органической кислоты никакого ингибирующего бактерии эффекта быть не может;

- во-вторых, антибиотики обладают избирательностью биологического действия. Это означает, что не все микроорганизмы чувствительны к конкретному антибиотику. В этой связи микроорганизмы делят на две группы: чувствительные к определенным антибиотикам и резистентные, или устойчивые, к ним.

Антибиотики часто объединяют в группы в зависимости от того, рост каких микроорганизмов они подавляют. Выделяют следующие группы антибиотиков: противовирусные, антибактериальные, противогрибковые, антипротозойные, противоопухолевые.

Чувствительность различных бактерий к антибиотикам определяется в значительной мере структурой клеточной стенки, поскольку от этого зависит способность антибиотика проникать в бактериальную клетку. В соответствии с активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий антибактериальные антибиотики можно разделить на две группы. Большинство антибиотиков действуют на грамположительные бактерии, через клеточную стенку которых эти соединения легче проникают, так как в ней нет дополнительного барьера наружной мембраны. Такие антибиотики относят к соединениям с узким спектром действия. Антибиотики, активные в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, называются антибиотиками широкого спектра действия.

Бактерицидный или бактериостатический эффект, вызываемый антибиотиками, как правило, связан с нарушением отдельных звеньев метаболизма или структур бактериальных клеток. В зависимости от механизма действия антибиотики делят на несколько групп:

- ингибирующие синтез клеточной стенки (пенициллины, бацитрацин, ванкомицин, цефалоспорины и др.);

- нарушающие функционирование цитоплазматической мембраны (грамицидины, валиномицин, полиены, трихомицин и др.);

- подавляющие синтез РНК (рифампицины, стрептоварицины и др.);

- подавляющие синтез ДНК (митомицин С, противоопухолевые,

новобиоцин и др.);

- ингибирующие синтез белка (хлорамфеникол, стрептомицин, канамицин, эритромицин, линкомицин, пуромицин, фузидиевая кислота, тетрациклины и др.).

Рассмотрим механизм действия некоторых антибиотиков.

Пенициллин ингибирует синтез пептидогликана муреина, входящего в состав клеточной стенки. В частности он нарушает образование пептидных связей в процессе синтеза пептидогликана, инактивируя ключевой фермент транспептидазу, ответственный за этот процесс. Синтезируется несшитый пептидогликан, в результате чего образуется «ослабленная» клеточная стенка, неспособная выдержать увеличивающееся в результате роста клетки, давление, что приводит к разрушению и лизису клеток.

Митомицин С блокирует синтез ДНК за счет того, что его молекулы связываются с ДНК в области репликативной вилки, образуя поперечные сшивки между цепями и препятствуя их разделению. ДНК-полимераза не может продвигаться по ДНК и осуществлять репликацию.

Актиномицин Д связывается с ГЦ-богатыми участками в молекуле ДНК и препятствует перемещению ДНК-зависимой РНК-полимеразы вдоль ДНК-матрицы из-за невозможности локального расплетания цепей и, следовательно, подавляет синтез информационной РНК.

Рифампицин подавляет синтез всех видов РНК, связываясь с β-субъединицей РНК-полимеразы.

Фузидиевая кислота блокирует функционирование фактора элонгации G, что препятствует транслокации рибосом и, следовательно, нарушает синтез белка.

Аминогликозидные антибиотики (стрептомицин, неомицин, канамицин и т.п.), группа тетрациклинов связываются с 30S-субъединицей рибосом, что прекращает биосинтез белка.

Хлорамфеникол и эритромицин ингибируют реакцию транспептидации, связываясь с 50S-субъединицами рибосом.

Грамицидин А включается в структуру клеточной мембраны, образуя каналы, стенки которых имеют липофильную природу снаружи и гидрофильную внутри, что позволяет катионам выходить из клетки.

Практическое использование антибиотиков заключается в следующем:

- при лечении инфекционных заболеваний человека и животных. Однако они могут оказывать побочное действие: вызывать аллергии, дисбактериоз, анафилаксический шок и даже смерть, поэтому принимать антибиотики следует с большой осторожностью;

- для защиты растений от болезней, вызываемых бактериями и грибами;

- для стимуляции роста сельскохозяйственных животных;

- для предотвращения порчи мяса, рыбы и других продуктов;

- в качестве инструментов для исследования специфических функций клетки (синтеза пептидогликана муреина, биосинтеза белка, транспорта ионов через мембрану и т.д.).