Естественная микрофлора рыбы

Лекционное занятие

«Глава 2. Основы гигиены и санитария. Тема2.2 «Санитарно-эпидемиологические требования к предприятиям рыбного хозяйства»

План:

1.    Влияние водной среды на микрофлору рыбы.

2.    Естественная микрофлора рыбы.

3.    Роль бактерий, ассоциированных с рыбой.

4.    Влияние микрофлоры на посмертные процессы в рыбе.

5.    Предотвращение распространения болезней рыб.

6.    Гигиена и дезинфекция на рыбоводческих предприятиях.

Влияние водной среды на микрофлору рыбы

Микробиота рыбы во многом зависит от окружающей ее среды, а в первую очередь зависит от водной среды.

Водную среду можно представить как открытую систему, в которой гидробионты постоянно взаимодействуют с микроорганизмами, которые присутствуют в толще воды, донных отложениях, а также ассоциированными с объектами питания.

По данным Канна и других исследователей (1965 г.), на рыбе, обитающей в теплых регионах, преобладают мезофильные микроорганизмы, а в холодных – психрофильные.

На распределение микроорганизмов в воде оказывают влияние следующие факторы: солнечная радиация, температура воды (теплые течения), слияние морских и речных вод, наличие органических веществ, характер сточных вод, время года, размножение планктона (выделение антибиотических веществ).

Видовой состав микроорганизмов, находящийся в воде, в основном представлен следующими родами: Pseudomonas, Micrococcus, Achromobacter, Corynefonus, Flavobacterium, Bacillus, Aeromonas, Cytrophage, Vibrio. В озерах встречаются представители тех же основных родов бактерий, что и в соленых морских водах. Наибольшую распространенность приобрели грамотрицательные палочковидные организмы (Pseudomonas, Vibrio, Flavobacterium, Acinetobacter, Moraxella), а также различные миксобактерии. Микроорганизмы, обитающие в воде аналогичны почвенным бактериям. В открытых водоемах обнаруживают гнилостные, нитрифицирующие, азотфиксирующие, серо- и микобактерии, нефтеокисляющие бактерии: Pseudomonas fluorescens,Sarcina lutea, Torularogea, Bacillus cereus и другие.

Поскольку внутренние воды часто загрязняются сточными водами, пресноводные рыбы могут являться носителями патогенных для человека болезнетворных бактерий, таких, как сальмонеллы, шигеллы, энтерококки, патогенные виды кишечных палочек, энторовирусы, стафилококки и другие. В иле и на морском дне обнаруживаются патогенные клостридии (Cl. botulinum, Cl. perfringens). В прибрежных районах Восточной Азии, а также в водах Северного, Балтийского, Средиземного и Черных морей выделены возбудители пищевых токсикоинфекций Vibrio Parahaemolyticus и другие бактерии рода Vibrio.

Поэтому, таксономический состав микробиоты рыбы находится в прямой зависимости от микробиоты окружающей ее воды, хотя существуют различия в содержании отдельных бактерий у разных видов рыб, выловленных в одном и том же районе. А также степень обсемененности рыбы зависит от способов лова. Так в свежей рыбе, выловленной тралом, содержится в 10–100 раз больше бактерий, чем в рыбе, которая была пойманной на удочку, что объясняется завихрениями морского грунта (ила, илистого наноса), образующимися при буксировке трала.

 

Естественная микрофлора рыбы

Очевидно, что рыба постоянно подвергается воздействию микроорганизмов, присутствующих в воде и донных отложениях, в том числе загрязняющих веществ в сточных водах/фекалиях. Эти микроорганизмы, несомненно, будут оказывать влияние на микрофлору внешних поверхностей, в том числе жабр. Точно также пищеварительный тракт будет получать воду и пищу, которая заселена микроорганизмами. Безусловно, колонизация вполне может начаться на стадии яйца и / или личинки и продолжаться с развитием рыбы.

Таким образом, количество и спектр микроорганизмов, присутствующих в яйцах, в пище и воде, будет влиять на микрофлору развивающихся рыб.

Из опубликованной литературы можно выделить три вероятных сценария судьбы бактерий, вступивших в контакт с рыбой:

1.  Организмы из окружающей среды рыбы тесто связаны с внешними покрова рыбы. Возможно накопление микроорганизмов в местах повреждения.

2. Организмы могут попадать в рот с водой или с пищей и проходить через пищеварительный тракт и/или колонизировать (заселять) его.

3.  Организмы, контактирующие с поверхностью рыбы, могут быть ингибированы резидентной (собственной) микрофлорой или естественными соединениями, присутствующими на рыбе или в рыбе.

Результаты многочисленных исследований показывают, что рыба обладает бактериальными популяциями на или в ее коже, жабрах, пищеварительном тракте и светоизлучающих органах. Кроме того, внутренние органы (почки, печень и селезенка) здоровой рыбы могут содержать бактерии, но существуют дискуссии о том, действительно ли мышечная ткань и сок свежевыловленной рыбы можно считать стерильными. По данным некоторых исследователей (Ульрих, Гин, Биссет, Мальтишевский, Патман) в ней иногда обнаруживаются единичные микробные клетки, что в очередной раз подтверждает связь микробиоты рыбы с микробиотой воды.

Согласно литературным данным известно, что рыбы имеют низкие бактериальные популяции на коже. Например, атлантический лосось (Salmo salar) из Великобритании, как сообщается, обладает микробными популяциями 10²-10³ культивируемых бактерий см^-2 кожи, в то время как радужная форель из Турции содержит бактериальные популяции 10¹-10⁷ г^-1. Однако следует подчеркнуть, что целесообразно использования веса в качестве единицы измерения для оценки популяций бактерий на коже является спорной. Интересно, что свежевыловленная кефаль из Австралии имела более высокую популяцию от 4 * 10³ до 8 * 10⁴ бактерий см^-2. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что численность бактериальных популяций отражает уровень загрязненности воды, то есть более высокие показатели присутствуют на рыбах в загрязненных водах.

На поверхности тела рыбы, в жабрах и кишечнике сконцентрировано наибольшее количество различных микроорганизмов.

Обнаружено, что жаберная ткань содержит большое количество бактериальных популяций, например, до 10⁶ бактерий г^-1 жаберной ткани.

Исследования, которые проводились на гидробионтах Баренцева моря, установили следующие бактерии рода, обитающие на коже и жабрах рыб: Pseudomonas (20-22 %), Achromobacter (50-60 %), Coryneformus, Flavobakterum, Vibrio (0,1-1,0). При хранении рыбы бактерии рода Achromobacter постепенно отмирают, хотя отдельные виды принимают участие в гнилостном разложении рыбы. В незначительном количестве были выделены бактерии рода Proteus. Бактерии рода Pseudomonas и Proteus обладают протеолитической активностью, которая играет важную роль при гнилостной порче рыбы, при хранее их процентное содержание резко возрастает. В свежевыловленной рыбе бактерии, принадлежащие к роду Pseudomonas (Рs. pelliculosa – до 40–50 %; Рs. qeniculata – до 20–30 %; Рs. parconacea – до 10–20 %; Рs. hiqrifaciens – до 10–20 %; Рs. schylkilliensis – до 10–20 %; Рs. fluorescens – до 10–20 %.), составляют в большинстве случаев менее 50 % от общего содержания бактерий.

Иногда обнаруживали бактерии видов Рs. ovalis, Рs. fraqi
и Рs. Multistriata. Ввиду своих резко выраженных протеолитических свойств они играют решающую роль в порче рыбы, так как их количественное содержание во всей микрофлоре быстро возрастает при хранении рыбы.

Количество бактерий, находящихся на 1 см² поверхности рыбы, может составлять от 10² до 10⁷ (или по другим данным от 10³ до 10⁶). Аналогичное количество бактерий выявляют и на наружных жабрах рыб.

Несмотря на то, что микробиота кишечника рыбы является примерно постоянной и менее зависимой от окружающей среды. Некоторые авторы считают, что состав микрофлоры желудочно-кишечного тракта сходен с микробиотой воды, жабр, кожи, пищевого комка. Но, тем не менее, в настоящее время считается, что рыба обладает специфической кишечной микробиотой, которая проще, чем у теплокровных.

Преобладающими формами бактерий считаются – аэробы или факультативные анаэробы. Но имеются сведения о присутствии в кишечнике рыб, особенно растительноядных, и облигатно анаэробных бактерий.

 К основным родам бактерий, которые чаще всего встречаются в кишечнике пресноводных рыб, относят: Enterobacter, Aeromonas и AcinetobacterEscherishia, Klebsiella, Proteus, Serratia, Alcaligenes, Eikenella, Bacteroides, Citrobacterfreundii, Hafniaalvei, Cytophaga/Flexibacter, Bacillus, Listeria, Propionobacterium, Staphylococcus, Moraxella, Pseudomonas.

Общая плотность популяция бактерий в кишечнике рыбы представляет собой своеобразную экологическую систему, которая подвержена действию различных эндогенных (возраст, тип питания рыбы, структура пищеварительного тракта, рН кишечного содержимого, ферменты, продуцируемые в кишечнике, осмотическое давление, иммунитет хозяина) и экзогенных (параметры окружающей среды) факторов.

Как известно с возрастом количество бактерий в пищеварительном тракте рыб увеличивается. Например, наибольшее количество бактерий установлено в пищеварительном тракте трехлеток белого амура Ctenopharyngodonidella (9.7×10¹² кл/г) и карпа Cyprinus carpio (8.8×10¹² кл/г).

Важно отметить, что до начала внешнего питания существенную роль на таксономический состав кишечника рыбы оказывает микробиота окружающей среды (вода), а в то время как с началом поглощения пищи главенствующую роль играет уже тип питания.

Так наибольшее разнообразие таксонов бактерий наблюдалось в кишечнике у эврифагов, планктофагов и бентофагов по сравнению с хищными видами рыб. Сравнение микробиоты сазана и судака, различающиеся по характеру питания (сазан – бантофаг, судак – ихтиофаг), показало, что разнообразие микроорганизмов у первого вида значительно богаче, чем у второго. Также было замечено, что в кишечнике рыбы, питающейся донной пищей и заглатывающей вместе с нею донные осадки, микроорганизмов больше, чем в кишечнике рыбы, питающейся планктоном.

Было отмечено, что активно питающиеся костистые рыбы обладают, бактериальной флорой в пищеварительном тракте, сходной с флорой кожи и жабр, часто это 10³ – 10⁸ организмов на грамм влажного веса ткани.

Исследование кишечной микрофлоры байкальского омуля показало, что при смене спектра питания увеличивается разнообразие доминирующих микроорганизмов, а стабильность питания ведет к формированию устойчивого микробного сообщества с небольшим числом таксономических единиц.

Была найдена прямая зависимость между интенсивностью питания и общим количеством бактерий в кишечнике. Так, например, во время зимовки и голодания пищеварительный тракт рыб не освобождается от бактериального населения. Однако в этот период наблюдается уменьшение количества бактерий в 10 раз, чем при интенсивном питании.

Численность гетеротрофных организмов в кишечнике леща (Amramisbrama) в зимние месяцы почти в миллион раз ниже, чем летом, в период активного питания (6´10² и 6´10⁷-7´10⁷ кл/мл соответственно).

Известно, что существуют принципиальные различия в структурной и функциональной организации разных отделов кишечника рыб.

Так, максимальная их численность установлена в переднем и среднем отделах, что позволяет предполагать участие бактерий в расщеплении питательных веществ. Присутствие большого числа бактерий в некоторых случаях в заднем отделе кишечника связывают с участием этих бактерий в расщеплении балластных веществ и с обеспечением рыб, как и млекопитающих, вторичными нутриентами.

Например, было установлено, что в переднем, среднем и заднем отделах кишечника черного байкальского хариуса доминируют разные микроорганизмы. В переднем и среднем отделах кишечника – это микроорганизмы, близкие по генотипу к Mycoplasma moatsii, а в заднем отделе – некультивируемые бактерии из филогенетической группы Спирохеты (Быковская, 2014).

В пищеварительном тракте рыбы принято различать:

· аллохтонную (транзиторная), временно присутствующую микробиоту, поступающая с водой и пищей (микробиота содержимого кишечника);

· автохтонную (перманентная индигенная микробиота), встречающаяся на всех стадиях развития (поверхность слизистой кишечника);

· «взрослая» форма, впервые определяемая примерно через 2 месяца после выклева из икры.

Многие исследователи (Cahiil,1990; Olaften, 2001; Ringo, 1999; Romero, 2006) считают, что микробиота пищеварительного тракта схожа с микробиотой воды и слизистой кишечника может сильно отличаться от его содержимого.

Так, например, для ихтиофагов (щука, судак, окунь) и мирных (серебряный карась, елец, плотва,) видов рыб оз. Чаны получены существенные различия в составе микробиоты слизистой кишечника по сравнению с его содержимым. Аллохтонная микробиота содержимого кишечника исследуемых видов рыб демонстрирует специфичность состава бактерий, определяемую типом питания, т.е. таксономический состав содержимого кишечника рыбы входит в состав аллохтонной микробиоты.

При исследовании автохтонной микробиоты такие закономерности не наблюдались, однако серебряный карась и плотва группируются в отдельный кластер в отличие от остальных видов рыб. Это связано с тем, что первичная кишечная микробиота молоди ихтиофагов и мирных рыб претерпевает значительные изменения по мере морфологического и физиологического усложнения кишечника, становления пищевой специализации и свидетельствует о становлении автохтонной микробиоты каждого вида рыб. Колонизация автохтонной микробиоты кишечника рыб начинается со стадии выклева личинки из икры и продолжается по мере роста и развития рыб.

Надо отметить, что общее количество бактерий у разных видов рыб колеблется в пределах от 10² до 10¹² кл. на 1 грамм влажного веса. Однако большинство авторов указывают на величины порядка 10⁵ – 10⁸ кл/г. Такой разброс в показателях численность связан, прежде всего, с видовым разнообразием изученных рыб, условиями их обитания и особенностями физиологии, типа питания, но и с методами исследования. Так как традиционные методы культивирования прикрепленной микрофлоры рыб, основываются на посеве гомогентов на различные селективные питательные среды, что позволяет обнаружить микроорганизмы, способные расти на специфических средах. А присутствующие анаэробные бактерии, большинство из которых не поддаются культивированию in vitro. Из-за чего происходит существенная недооценка численности популяции бактерий. Согласно результатам Ringo et al. (2001), с задним отделом кишечника рыб связано приблизительно 3,3´10⁵ бактерий. Надо отметить, что только 25% (1´10⁵) энтероцитов задней кишки колонизированы, а каждый энтероцит несет на себе 100 бактерий, получается примерно 1´10⁷ бактерий, то есть культивируется всего лишь 3% общей бактериальной популяции, связанной с задним отделом кишечника.

Поэтому наряду с традиционными микробиологическими подходами для анализа микробиоты кишечника рыб широкое распространение получили молекулярно-генетические методы, позволяющие наиболее полно оценить разнообразие бактерий, например, метод пиросеквенирования.

В настоящее время в научной литературе все чаще появляются результаты исследования нормальной микробиоты рыб, полученные с использованием молекулярно-генетических анализов.

Молекулярная идентификация отдельных бактериальных таксонов основывается на амплификации фрагмента гена 16S рРНК с использованием консервативных праймеров на домен Eubacteria и последующим секвенированием или использованием специфических праймеров на филогенетические группы разного таксономического уровня, что становятся мощным инструментом для изучения микробиоты кишечника рыб. Первоначально эти методы широко использовали для уточнения видовой принадлежности культивируемых штаммов и для быстрой и эффективной видоспецифичной диагностики бактериальных возбудителей инфекционных заболеваний рыб.

Большинство авторов отмечают различия в разнообразии доминирующей микрофлоры, полученные с применением классического микробиологического подхода и молекулярно-генетических методов.

Важно отметить, что при проведении молекулярно-генетических анализов необходимо учитывать условия забора биологического материала, методы выделения суммарной ДНК и условия получения специфичного ПЦР-продукта.

Благодаря использованию данного метода было показано, что Proteobacteria – наиболее распространенная группа в составе кишечной миробиоты пресноводных видов рыб. Так, у белого амура Ctenopharyngodonidella в содержимом кишечника доминировали Proteobacteria и Firmicutes. Субдоминантами выступали Cyanobacteria. C помощью микробиологических подходов продемонстрировано, что субдоминантами в составе микробиоты содержимого кишечника белого амура выступали Bacteroides и Acinobacteriа.

Таким образом, микробиота рыбы находится в непосредственной зависимости от окружающей среды (вода) и объектов питания аквакультуры. Изменения, происходящие в окружающей среде, непосредственно влияют как на таксономический состав, так и на количественные характеристики микробиоценоза рыбы. При этом надо учитывать, что традиционные методы культивирования не отражают действительное количество микроорганизмов.