Поведенческие проявления тревоги у животных и тревожные расстройства у людей, как правило, сопровождаются различного рода изменениями на соматическом уровне. Нами на уровне экспериментальных исследований было продемонстрировано, что анксиолитическое действие селанка и даларгина у животных сопровождается коррекцией стресс-индуцированных соматических нарушений сердечно-сосудистой и иммунной систем. На данном этапе работы были выбраны те же условия, в которых проводилось тестирование анксиолитического действия даларгина и селанка.
Так, ранее при тестировании тревожности мышей Balb/c в ПКЛ было обнаружено, что внутрибрюшинные уколы физиологического раствора значительно повышают их тревожность и на этом фоне селанк оказывает выраженное анксиолитическое действие, которое блокируется налоксоном (рис. 3). В исследовании, проведенном по той же схеме на 48 мышах-самцах линии Balb/c, удалось обнаружить кардиотропный эффект селанка. Повышение тревожности, вызванное введением физиологического раствора, сопровождалось стойким повышением ЧСС мышей по сравнению с контрольными животными (632±25 и 527±16 ударов/мин в среднем за 5 мин наблюдения, соответственно, p<0.01). На этом фоне однократное введение селанка (100 мкг/кг) достоверно снижает ЧСС мышей (496±26 ударов/мин в среднем за 5 мин наблюдения) по сравнению с животными, получившими уколы физиологического раствора (p<0.01).
|
|
На рисунке 11 представлена динамика сердечного ритма мышей, наблюдавшаяся в течение 5 мин с момента введения электродов мышам, не получавшим до этого никаких инъекций («интактные»), и животным, которым за 30 мин до этого ввели физиологический раствор или селанк. Из рисунка видно, что непосредственно после введения электродов ЧСС «интактных» мышей значительно выше, чем на 2–5 минутах наблюдения (622±17 и 478±23 ударов/мин в первые и последние 30 сек из 5 мин наблюдения, соответственно, p<0.01). Очевидно, это связано с процедурным стрессом введения электродов. Судя по ЧСС, этот стресс сопоставим со стрессом уколов физиологический раствор. Однако, в отличие от «интактных» животных, у мышей, получивших укол физиологический раствор в течение 5 мин тестирования не наблюдается релаксации (снижения сердечного ритма), что соответствует поведенческим данным о повышенной тревожности мышей этой линии, наблюдаемой через 30 мин после укола физиологический раствор (рис. 3).
Введение селанка предотвращает повышение ЧСС мышей в момент введения электродов (460±34 ударов/мин в первые 30 сек наблюдения, p<0.01 по сравнению с тем же показателем у «интактных» животных) и на всем протяжении тестирования достоверно снижает ЧСС мышей по сравнению с животными, получившими уколы физиологический раствор. Сердечный ритм мышей, получивших селанк, в течение 5 минут тестирования достоверно не меняется и остается на уровне ЧСС «интактных» мышей к моменту релаксации после процедурного стресса.
|
|
Таким образом, в данном исследовании нам удалось обнаружить кардиотропный эффект селанка, который проявляется в том, что введение этого препарата снижает тахикардию, вызванную как анксиогенным для мышей Balb/c стрессом внутрибрюшинно введения физиологический раствор, так и процедурным стрессом введения электродов.
Рисунок 11. Влияние селанка на динамику сердечного ритма мышей Balb/c в условиях процедурного стресса. ЧСС измеряли в течение 5 мин с момента подкожного введения электродов «интактным» мышам и мышам, получившим внутрибрюшинно инъекции физиологический раствор или селанка (100 мкг/кг) за 30 мин до начала тестирования
*, **, *** – p<0.05, 0.01, 0.001 – отличие от ЧСС мышей, получавших физиологический раствор, измеренной в тот же временной интервал.
В настоящее время доказано, что эндогенные опиоидные пептиды, в частности, лей- и мет-энкефалины обладают кардиопротективными свойствами. Помимо центрального действия на эмоциогенные зоны мозга и ядра, отвечающие за вегетативную регуляцию сердечно-сосудистой системы, опиоидные пептиды влияют на симпатическую и парасимпатическую регуляцию сердца и кровеносных сосудов, предотвращая избыточный выброс медиаторов из нервных окончаний соответствующих вегетативных нейронов и нивелируя гиперактивацию адренергических рецепторов на уровне трансмембранной передачи. Считается, что таким путем эндогенные опиоиды предотвращают развитие аритмии, гипертрофии сердца и апоптоз кардиомиоцитов в условиях гиперактивации симпатической нервной системы, например, при хроническом стрессе (Pepe et al., 2004). Кроме того, опиоидные пептиды играют существенную роль в кардиогенезе, выживаемости кардиоцитов в условиях ишемии, репаративных процессах при инфаркте миокарда (Peart et al., 2005).
Таким образом, использование Селанка как ингибитора ферментов деградации эндогенных опиоидных пептидов (энкефалинов) при лечении больных, у которых тревожные расстройства сопровождаются сердечно-сосудистыми заболеваниями, патогенетически вполне обоснованно.
Исследование иммуномодулирующего действия даларгина также проводили в условиях анксиогенного стресса, сопровождающего тестирование животных в «челночных камерах». Изучали пролиферативную активность лимфоцитов крови 84 крыс-самцов популяции Wistar, прошедших обучение в «челночной камере» и получивших после этого пятидневный курс внутрибрюшинного введения физиологического раствора (контрольная группа) или даларгина (20 мкг/кг). В процессе исследования определяли спонтанную пролиферацию лимфоцитов и пролиферативную активность, стимулированную КонА в различных дозах. Затем экстраполяцией кривой доза-эффект вычисляли ту дозу митогена, при которой наблюдается максимальная пролиферация, и определяли индекс стимуляции лимфоцитов по соотношению оптимальной и спонтанной пролиферации. По общей выборке не было обнаружено достоверных отличий между уровнем пролиферации лимфоцитов крови контрольных крыс и крыс, получавших даларгин. Введение даларгина лишь понизило чувствительность клеток к митогену: оптимальная концентрация КонА повысилась от 10.8±1.2 (в контрольной группе) до 14.1±1.0 мкг/мл (p<0,05).
В процессе статистической обработки результатов животные были разбиты на 3 подгруппы в соответствии с их исходной двигательной активностью в ATS. В результате обнаружилось, что спонтанная пролиферация лимфоцитов крыс со «средней» двигательной активностью (СА) значительно ниже, чем у высоко – (ВА) и низко – (НА) активных животных (табл. 10). Величина спонтанной пролиферации в значительной степени отражает функциональную активность лимфоцитов in vivo. Ее изменение может происходить не только под воздействием попадающих в организм антигенов (вирусы, бактерии, искусственная иммунизация и т.д.), но и в результате действия стрессогенных факторов, воздействующих на иммунную систему через ЦНС и нейроэндокринную систему (Pedersen, 1991). Повышение спонтанной пролиферации лимфоцитов НА и ВА крыс по сравнению с СА животными говорит о включении последнего механизма, поскольку с точки зрения антигенных воздействий все животные находились в одинаковых условиях. Возможно, это результат стресса, вызванного обучением в «челночных камерах».
|
|
Таблица 10. Влияние даларгина (внутрибрюшинно, 5 дней, 20 мкг/кг ежедневно) на пролиферативную активность лимфоцитов крови крыс популяции Wistar, прошедших курс обучения в «челночной камере»
показатели пролиф. активн. | Вводимый препарат | Двигательная активность животных | ||
низкая (n=28) | средняя (n=28) | высокая (n=28) | ||
Спонтанная пролиферация | физ. р-р | 1114±172 ** | 453±98 | 783±110 * |
даларгин | 639±55 ** # | 399±44 | 834±135 ** | |
Оптимальная пролиферация | физ. р-р | 18380±3873 ** | 39680±3490 | 55247±10860++ |
даларгин | 38899±9375 # | 38502±5073 | 39871±8231 | |
Индекс стимуляции | физ. р-р | 24±6 ** | 128±26 | 80±19 * ++ |
даларгин | 49±8 ** # | 102±13 | 63±12 * | |
Оптимальная конц. КонА | физ. р-р | 11.4±1.6 | 10.4±1.5 | 10.6±1.2 |
даларгин | 15.9±1.7 | 12.2±0.8 | 14.2±1.0 # |
** p<0.01, * p<0.05 – отличие от среднеактивных,
++ p<0.01 – отличие между высоко- и низкоактивными,
# p<0.05 – эффект даларгина.
Приведены средние значения ± ошибка среднего.
Введение даларгина практически в 2 раза снижает спонтанную пролиферацию лимфоцитов крови НА крыс и не влияет на этот параметр у СА и ВА животных (табл. 10).
Пролиферативный ответ лимфоцитов крови на оптимальную дозу КонА возрастает по мере увеличения исходной двигательной активности исследуемых животных. Оптимальная пролиферация лимфоцитов крови НА крыс в 2 раза ниже, чем у СА крыс, и в 3 раза ниже, чем в группе ВА животных (табл. 10). Введение даларгина оказывает нормализующий эффект на этот параметр: в 2 раза увеличивает его у НА, не влияет на СА и снижает, хотя и в виде тенденции, у ВА крыс. В результате после введения даларгина пролиферация лимфоцитов в присутствии оптимальной дозы КонА во всех группах крыс становится одинаковой (табл. 10). Еще один параметр пролиферативного иммунного ответа – индекс стимуляции лимфоцитов оптимальной дозой митогена – отражает функциональный резерв ответа иммунокомпетентных клеток на митогенный стимул с учетом их исходного состояния. С точки зрения «резервных» способностей лимфоцитов крови, оцениваемых по этому параметру, в наиболее выгодном состоянии находится иммунная система СА крыс: по сравнению с ними индекс стимуляции лимфоцитов у ВА крыс снижен в 1.5 раза, а у НА – в 5 раз (табл. 10). Курсовое введение даларгина в 2 раза повышает индекс стимуляции в группе НА и не влияет достоверно на остальных животных (табл. 10).
|
|
Анализ индивидуальных величин концентраций КонА, при которых наблюдается максимальный пролиферативный ответ лимфоцитов крови, показал отсутствие различий по этому параметру между животными выделенных групп (табл. 10). Введение даларгина понизило чувствительность лимфоцитов к митогену у всех животных, но наиболее выражено этот эффект наблюдался у ВА крыс (табл. 10).
Обучение в «челночной камере» является тестом, основанным на выработке условного рефлекса, подкрепляемого аверсивным стимулом, предъявление которого, по определению, сопровождается тревожной реакцией у животного. Анксиолитический эффект даларгина в этом тесте, выражающийся в снижении реактивности на условный сигнал, был обнаружен лишь у ВА крыс. В этой же группе животных под действием даларгина снизилась повышенная в результате стресса реактивность лифоцитов на КонА (табл. 10). Несмотря на отсутствие видимых поведенческих эффектов даларгина на НА крыс в тесте «челночная камера», этот пептид оказал выраженное стимулирующее влияние на иммунную систему НА животных, подавленную в результате хронического анксиогенного воздействия.
Таким образом, анксиолитическое действие селанка и даларгина на животных сопровождается коррекцией стресс-индуцированных соматических нарушений на уровне сердечно-сосудистой и иммунной систем. Селанк снижает тахикардию, индуцированную процедурным стрессом у мышей Balb/c, а курсовое введение даларгина оказывает нормализующий иммуномодулирующий эффект на фоне стресса, вызванного обучением в «челночной камере».
Заключение
Таким образом, собственные и литературные данные свидетельствуют об участии опиоидной системы в регуляции уровня тревожности. Биологические механизмы вариабельности анксиолитических эффектов препаратов, воздействующих на опиоидную систему, связаны с гетерогенностью опиоидных рецепторов, соотношением процессов экспрессии и десенситизации различных их подтипов, синтеза и деградации эндогенных опиоидов. Так, связанный с модуляцией опиоидной системы анксиолитический эффект селанка проявляется в условиях повышенной активности ферментов деградации эндогенных опиоидов. Установлено, что коррекция состояния опиоидной системы с использованием пептидных препаратов может с успехом применяться при терапии некоторых форм тревожных расстройств, сопровождающихся истощением эндогенной опиоидной системы, в частности, ГТР. В заключение можно сказать, что стимуляция опиоидной системы агонистами ОР дельта-типа и ингибиторами ЭДФ сопровождается анксиолитическим эффектом на фоне генетически обусловленной или определяемой внешней средой недостаточности функциональной активности эндогенной опиоидной системы.
Выводы
1. Синтетический аналог энкефалинов даларгин, преимущественно взаимодействующий с опиоидными рецепторами (ОР) дельта-типа, но не ДАГО, лиганд ОР мю-типа, снижает поведенческие проявления тревожности животных в тестах «Открытое поле», «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ), «Конфликтный тест Вогеля», «Челночная камера» как при центральном, так и при периферическом введении. Анксиолитический эффект даларгина наблюдается на фоне дополнительных стрессорных воздействий, приводящих к повышению уровня тревожности, и зависит от исходного поведенческого статуса животных.
2. Обнаружены отличия в плотности и аффинности центральных ОР к лиганду δ- и μ-ОР ДАДЛЭ, активности эндогенных лигандов ОР в гиппокампе и в плазме крови, скорости деградации лей-энкефалина в плазме крови животных с различными поведенческими проявлениями тревожности.
3. Обнаружена взаимосвязь между активностью энкефалиндеградирующих ферментов (ЭДФ) плазмы крови и конституционально-личностными характеристиками людей. Время полупревращения (τ1/2) лей-энкефалина в плазме крови здоровых людей прямо коррелирует с уровнем личностной тревожности по Спилбергеру и обратно – с уровнем экстравертированности по Айзенку. В условия развития генерализованного тревожного расстройства (ГТР) различия по τ1/2 между пациентами с различным уровнем экстравертированности нивелируются. При этом τ1/2 лей-энкефалина в плазме крови больных ГТР положительно коррелирует с выраженностью ряда симптомов тревожной, астенической и гипотимической групп, а также вегетативных расстройств, присущих этому заболеванию.
4. В плазме крови больных ГТР достоверно снижено как τ1/2, так и максимальная скорость реакции гидролиза лей-энкефалина по сравнению со здоровыми донорами и больными агорафобией и паническим расстройством, что свидетельствует о недостатке эндогенных ингибиторов ЭДФ у больных ГТР.
5. Селанк и его пептидные фрагменты, тафтсин и Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, ингибируют активность ЭДФ плазмы крови человека и мембранной фракции мозга крысы in vitro. Наиболее выражено ингибирующее действие селанка на дикарбоксипептидазы, которые, в частности, ангиотензинпревращающий фермент, непосредственно участвуют в его гидролизе.
6. Один из механизмов поведенческих эффектов селанка связан с действием на опиоидную систему: анксиолитическое действие селанка на мышей Balb/с, регистрируемое в тесте ПКЛ, блокируется антагонистом ОР налоксоном. Анксиолитический эффект препарата на мышей Balb/с, с фенотипом повышенной тревожности в тесте «открытое поле» сопровождается снижением скорости распада энкефалинов в их крови. Ведение селанка резистентным к анксиолитическому действию этого препарата мышам C57Black/6 не влияет на активность ЭДФ в их крови.
7. Выраженный клинический эффект селанка наблюдается при ГТР, характеризующемся недостатком эндогенных ингибиторов ЭДФ. В результате терапии селанком, но не медазепамом происходит повышение среднего значения τ 1/2 лей-энкефалина в сыворотке крови больных ГТР.
8. Анксиолитическое действие селанка и даларгина на животных сопровождается коррекцией стресс-индуцированных соматических нарушений на уровне сердечно-сосудистой и иммунной систем. Селанк снижает тахикардию, индуцированную процедурным стрессом у мышей Balb/c. На фоне стресса, вызванного обучением в «челночной камере», курсовое введение даларгина оказывает нормализующий эффект на Т-клеточное звено иммунитета крыс.
9. Стимуляция опиоидной системы агонистами ОР дельта-типа и ингибиторами ЭДФ вызывает анксиолитический эффект на фоне генетически обусловленной или определяемой внешней средой недостаточности функциональной активности эндогенной опиоидной системы. Использование подобных препаратов патогенетически обосновано при терапии и профилактике тревожных расстройств и стресс-индуцированных нарушений сердечно-сосудистой и иммунной систем.