Идентификация лимфоцитов и их субпопуляций

Лимфоциты выделяют из периферической крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина в течение 45 мин при 400 g (Bouym A., 1968). Принципданногометода – различнаяскоростьоседанияклетоквградиентеплотности, взависимостиотихудельнойплотности. Длявыделениялимфоцитовиспользуютсмесь, состоящуюиз 12 частей 9% фиколлаи 5 частей 33,9% верографина, имеющуюплотность 1,077. Цельнуюкровь, нанесеннуюнаэтусмесь, центрифугируют, иклеткисразличнойудельнойплотностьюразделяются. Лимфоцитыимоноцитыостаютсянаградиентеплотности, таккакимеютплотность 1,077, аэритроцитыигранулоцитыоседаютнаднопробирки (рис. 25).

Соотношениеобъемовградиентаиразделяемойсуспензиидолжнобыть 1:2–1:5. Интерфазныйслойотсасывают, добавляютфизиологическуюсредуиотмываютвыделенныемононуклеары (3 раза).

В настоящее время самым точным и высокотехничным методом определения фенотипа иммунокомпетентных клеток является лазерная проточная цитометрия, по

Рис. 25. Разделение клеток после центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина

зволяющая идентифицировать клетки после их специфического связывания с МКАТ против поверхностных антигенов клеток и окрашивания антиглобулиновыми антимышиными антителами, меченными флюорохромом (ФИТЦ) (рис. 26).

Антиглобулиновое антитело

Проточная цитометрия позволяет идентифицировать субпопуляции клеток, определить частоту их встречаемости и получить количественные

МКАТ

характеристики субпопуляций. Проточный цитометр состоит из трех ос

ФИТЦ

новных блоков: оптического, где производится измерение, блока обработки сигналов, где сигналы усиливаются и

Рис. 26. Схема специфического связывания клетки с МКАТ и окрашивания антителами, меченными ФИТЦ

преобразуются из оптических в электрические, блока сбора и обработки данных (компьютер). Оптический блок предназначен для измерения рассеяния света и флуоресценции   (рис. 27). Клетки вводят в поток жидкости, ширина которого составляет 50-100 мкм. На струе сфокусирован лазер. В момент прохождения клеток через луч лазера они рассеивают свет во всех направлениях и испускают небольшое количество света за счет флуоресценции. Переднее рассеивание света – forward – обусловлено размером клетки и другими характеристиками, на основе этого параметра происходит отделение живых лимфоцитов от мертвых лимфоцитов и эритроцитов. Перпендикулярное или боковое рассеяние света под углом 90° по отношению к лазерному лучу позволяет идентифицировать популяции клеток по характеру зернистости клеток (лимфоциты, нейтрофилы, моноциты). Флуоресцентные сигналы измеряют с помощью разделяющих, дихроических и обычных зеркал. На основе измерения флуоресцентных сигналов определяется фенотип клетки, степень ее активации и дифференцировки. В блоке обработки поступающие от детектора сигналы усиливаются, анализируются. Из блока обработки сигналы посылаются в блок хранения – ПЭВМ. Обычно данные представляются в виде гистограмм.

Фенотип лимфоцитов можно определять и с помощью люминесцентной микроскопии. Под микроскопом клетки, связавшие соответствующие МКАТ и антиглобулиновые антитела, меченные ФИТЦ, имеют специфическое свечение.

Рис. 27. Схема проточной лазерной цитометрии

 

В настоящее время с помощью МКАТ идентифицирован ряд поверхностных антигенов лейкоцитов, обозначаемых, как известно, буквами CD (от «кластер дифференциации») и соответствующим номером. В табл. 10 приведена характеристика ряда значимых для клинической иммунологии антигенов.

 

Таблица 10

Характеристика CD-антигенов

 

CD-антиген	Молекулярная масса, Кд	Экспрессия	Функции
CD3	20-28	Тимоциты Т-клетки	Все периферические Т-клетки экспрессируют. СD3 – это TCR-ассоциирован-ный комплекс, участвующий в передаче сигнала в клетке. СD3 является маркером Т-клеток
CD4	55	Субпопуляция Т-клеток (Т-хелперы), распознающая антигены, ассоциированные с молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса	Лиганды: молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса. Регуляция внутритимической дифференцировки, Т-В-клеточной адгезии, корецептор в Т-клеточной активации

Окончание табл. 10

CD-антиген	Молекулярная масса, Кд	Экспрессия	Функции
CD8	32-34	Большинство тимоцитов, 30% Т-клеток в ПК и субпопуляция NK-клеток	Лиганды: молекулы главного комплекса гистосовместимости I класса. Регуляция внутритимической дифференцировки, Т-В-клеточной адгезии, корецептор в Т-клеточной активации. Маркер цитотоксических Т-клеток
CD16	50-80	Большие гранулярные лимфобласты, NK-клетки, нейтрофилы	Низкоаффинный рецептор агрегированного IgG (FcγRΙΙΙ)
CD20	33-37	Антиген, специфический для В-клеток, клетки со стадии пре-В-клеток до В-бластов	Активация В-клеток, возможно, является компонентом Ca++ каналов