double arrow

Б. Реагенты, избирательно расщепляющие пептидные цепи

Одним из самых ценных реагентов при работе с белками является фенилизотиоцианат, впервые примененный Эдманом. Это соединение раегирует с N-концевой аминогруппой пептидов, образующийся продукт циклизуется и в кислой среде связь разрывается. Образуется фенилгидантоин, который можно идентифицировать. Проделав ту же операцию с укороченной пептидной цепью, можно определить следующий аминокислотный остаток.

На основе фенилизотиоцианатного метода Эдмана работают специальные приборы – секвенаторы, в которых все эти операции осуществляются автоматически. Метод Эдмана сводится к обработке фенилизотиоцианатом белка или пептида, присоединенного через С-концевую аминокислоту к инертному носителю (полистиролу или пористому стеклу) в колонке секвенатора. После промывки колонки метанолом и дихлорэтаном образовавшийся фенилтиокарбамилпептид подвергается воздействию безводной трифторуксусной кислоты, в результате чего высвобождается анилинотиазолинон и в его составе N-концевая аминокислота, а укороченный на один остаток пептид остается связанным с носителем. Анилинотиазолинон поступает в коллектор фракций и далее, после превращения в водной среде в фенилтиогидантоин – на хроматографическое определение отщепившейся N-концевой аминокислоты. После промывки растворителями, секвенатор готов к следующему циклу работы в автоматическом режиме.

Аминокислотную последовательность можно определять масс-спектрометрией, хотя этот метод сложен и применяется пока лишь к коротким 10-членным пептидам. Метод состоит в фрагментации аминокислотного типа эфиров ацилпептидов воздействием электронного удара с последующим разделением в масс-спектрометре полученных положительно заряженных фрагментов.




Существует множество других реагентов, расщепляющих пептидные связи внутри цепи в специфических местах. Особенно ценен бромциан, разрывающий цепь вслед за остатками метионина. Сера метионина замещает ион брома. Пространственная конфигурация образующегося сульфониевого соединения благоприятствует разрыву С-S-связи, протекающему с участием соседней пептидной группы. Гидролиз связи C=N в полученном продукте обусловливает разрыв пептидной цепи.

пептидилгомосеринлактон

Обработка гидроксиламином при высоких значениях рН часто приводит к избирательному разрыву связей Asp-Gly.






Сейчас читают про: