Методы культивирования вирусов

Вирусы не способны культивироваться на питательных средах, т.к. являются внутриклеточными паразитами.

1. Метод культивирования в организме чувствительных экспериментальных лабораторных животных.

Ограничения:

1) не все вирусы человека размножаются в организме лабораторных животных;

2) в организме экспериментальных животных есть иммунная система, которая может оказывать влияние на размножение вирусов.

2. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах.

Куриные эмбрионы имеют двухслойную экто- и энтодермальную хорион-аллантоисную оболочку; желточный мешок построен из мезодермальных клеток. Т.о., куриный эмбрион содержит ткани любого происхождения.

Куриный эмбрион не обладает иммунологической активностью.

Дешевле по сравнению с лабораторными животными. После заражения куриных эмбрионов они погибают вследствие размножения вирусов. На оболочках эмбриона могут образовыватся бляшки – мелкие зернистые образования. Вирус накапливается в жидкости куриного эмбриона.

Но: в куриных эмбрионах размножаются не все вирусы человека.

3. Метод культивирования вирусов в культуре ткани:

– для культивирования вирусов вне организма; используют эмбриональные, опухолевые клетки, которые активно размножаются в питательных средах для культуры тканей.

Типы культур тканей:

1) перевиваемые тканевые культуры – культуры обычно опухолевых клеток. Они стандартные. Их нужно постоянно поддерживать, они одинаковы во всех лабораториях мира;

2) первично-трипсинизированные тканевые культуры - культуры эмбриональных тканей, которые готовятся каждый раз по мере надобности: эмбриональную ткань измельчают, затем подвергают обработке трипсином (чтобы разрушить межклеточные связи), центрифугируют отдельные клетки. Эти культуры ткани обладают хорошими ростовыми качествами, но они не стандартны.

Для поддерживания культур ткани служат специальные синтетические питательные среды.

Культивирование вирусов под агаровым покрытием (однослойные культуры тканей) дает возможность получить потомство отдельных вирионов.

Методы регистрации размножения вирусов

1. Организм животного:

- Гибель;

- Выработка антител;

- Наличие антигена;

- Изменения в организме животного (болезнь).

2. Куриный эмбрион:

- Гибель;

- Бляшки на оболочках;

- Титрование антигена.

3. Культура ткани:

При размножении вирусов проявляются изменения, которые не свойственны здоровым клеткам:

- ЦПЭ (цитопатический эффект);

- У культивируемых вирусов есть феномен гемадсорбции (в результате избыточного синтеза гемагглютинин экспрессируется на наружную поверхность клеток культуры ткани и они приобретают способность адсорбировать эритроциты);

- появление в клетках включений – морфологических структур, которые обнаруживаются только в зараженных вирусом клетках культуры ткани.

Виды включений:

1) по локализации:

- ядерные

- цитоплазматические

- смешанные.

2) По характеру окраски по Романовскому-Гимза:

– эозинофильные;

– базофильные.

Типы включений характерны для определенного вируса.

- Учет размножения вирусов в культуре ткани (метод цветной пробы – ориентировочный тест, который говорит о нарушении клеточного метаболизма):

- если культура ткани не заражена, в клетках протекают процессы метаболизма, продукты метаболизма обнаруживаются в питательной среде, рН изменяется в кислую сторону, изменяется цвет индикатора;

- если культура ткани заражена вирусом, нарушения клеточного метаболизма, продукты метаболизма не обнаруживаются в питательной среде, рН не меняется, индикатор не меняет цвет.

Культуры тканей по чувствительности к вирусам делятся на 3 группы:

1) пермессивные (поддерживает вирусную инфекцию);

2) непермессивные (не способны поддерживать вирусную инфекцию);

3) полупермессивные (вирус поддерживается, но не размножается; такие клетки передают вирусную инфекцию при контакте с другими клетками).

Особенности противовирусного иммунитета

На вирус развивается полноценный иммунный ответ.

Вирус существует в организме в двух формах. В отношении внеклеточного вируса действуют те же механизмы противомикробной резистентности, что и в отношении бактерий.

Неспецифические механизмы:

- клеточная ареактивность – отсутствие специфических рецепторов для вирусов на клетках организма;

- лихорадочная реакция;

- выделительные механизмы: чихание, кашель;

- барьерная функция кожи и слизистых оболочек;

- фагоцитарный механизм.

Его особенности: при бактериальных инфекциях – лейкоцитоз, при вирусных – лейкопения. Т.к. нейтрофильные лейкоциты фагоцитируют вирус, он в них размножается и они гибнут. Защитное значение имеет фагоцитоз клеток, пораженных вирусом – на поверхности таких клеток экспрессируются вирусные белки, что делает их объектом макрофагального фагоцитоза, отсюда – моноцитоз, характерный для вирусных инфекций.

- гуморальный иммунитет: система комплемента, пропердина и вирусные ингибиторы – это химические группировки и радикалы, тождественные вирусным рецепторам, и они их блокируют.

Специфические механизмы иммунитета

Роль антител особая. Уровень сывороточных антител и устойчивость к вирусам не идут параллельно. При вирусной инфекции важно не количество антител, а их локализация в организме – на месте входных ворот или на территории пораженных тканей.

Большую роль при вирусной инфекции играет клеточный иммунитет. Это связано с тем, что инфицированные вирусом клетки становятся мишенью для цитолитического действия Т-киллеров.

Интерференция вирусов:

При заражении двумя разными вирусами одной ткани один подавляет другой. Это явление лежит в основе невосприимчивости к вирусным инфекциям. Это

Интерферон – индуцибельный белок клеток позвоночных, появляется под влиянием интерфероногенов. Один из них – вирусная инфекция. Основная функция интерферона: подавление размножения вирусов.

Виды (в зависимости от продуцирующей клетки):

α – лейкоцитарный;

β – фибробластический;

γ – генно-инженерный.

Интерферон – важнейший фактор, обладающий многогранной биологической активностью: стимулирует фагоцитоз, киллерную функцию Т-лимфоцитов, подавляет синтез комплемента, снижает гемопоэз, снижает развитие реакций гиперчувствительности замедленного и немедленного типов.

Интерферон обладает активностью в отношении внутриклеточных вирусов. Он нарушает трансляцию иРНК на рибосомах, что ведет к прекращению синтеза вирусных белков.

Интерферон появляется в клетке уже через 2 часа после заражения вирусом. Защищает практически от всех видов вирусных агентов.

Особенности интерферона:

- подавляет репродукцию любых видов вирусов (т.е. не обладает специфичностью);

- Обладает видовой специфичностью (защищает только свой вид).

Универсальность интерферона делает его незаменимым в терапии вирусных инфекций.

Интерферон обеспечивает защиту на уровне нуклеиновой кислоты, т.е. поддерживает нуклеиновый гомеостаз, а антитела и Т-лимфоциты – белковый гомеостаз.

Индукторы синтеза эндогенного интерферона:

- естественные (бактерии, вирусы, ЛПС);

- синтетические (крупномолекулярные соединения: полифосфаты, поликарбонаты и т.п.)

Применение интерферона:

- средство антивирусной терапии.

Химиотерапия вирусных инфекций

С помощью химиотерапевтических препаратов воздействуют на различные этапы взаимодействия вируса с клеткой: тормозят адсорбцию вирусов на клетках.

Основные препараты:

– производные ремантадина строго специфичны (ремантадин – при вирусах гриппа А);

– производные марборана (онковирусы, вирус оспы и т.д.);

– производные гуанидина;

– структурные аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований (фтортимедин, фтордезоксиурацил, азидотимедин и т.п.);

Встраиваются в вирусную нуклеиновую кислоту → вирусы теряют инфекционность.

Специфическая профилактика вирусных инфекций

Вирусные вакцины: живые и убитые.

В настоящее время живые вакцины используется…, т.к. возможна реверсия аттенуированных штаммов.

Средство экстренной профилактики: иммунные сыворотки, интерферон.

Экстренная профилактика кори – коревой γ-глобулин. Чаще используются химические и генно-инженерные вакцины.

Принципы классификации вирусов

По типу нуклеиновой кислоты вирусы делятся на:

- РНКовые

- ДНКовые

По размерам вириона на:

- крупные (более 100 нм);

- средние (50-100 нм);

- мелкие (меньше 50 нм).

По типу симметрии нуклеокапсида на:

- спиральные;

- кубические;

- смешанные.

По наличию или отсутствию суперкапсидной оболочки.

По антигенной структуре.

По типу репликации нуклеиновой кислоты.

Главную роль в патологии человека играют РНКовые вирусы к ним относятся:

- сем. Ортомиксовирусы

- сем. Парамиксовирусы

- сем. Ретровирусы

- сем. Пикорновирусы и т.д.

ДНКовые вирусы, патогенные для человека. Это:

- вирус герпеса;

- вирус папилломы, полиомы и бородавок;

- Аденовирусы (постоянные обитатели глоточного кольца), могут вызывать ОРВИ, ОРЗ;

- сем. Поксвирусов, включающее вирус натуральной оспы.

Происхождение вирусов

Происхождение вирусов – вопрос, который на протяжении многих лет составлял предмет дискуссий.

Было выдвинуто три гипотезы:

1. Вирусы – потомки бактерий и других одноклеточных организмов, претерпевших дегенеративную (регрессивную) эволюцию.

2. Вирусы – потомки древних доклеточных форм жизни, перешедших к паразитическому способу существования.

3. Вирусы – дериваты (производные) клеточных генетических структур, ставших относительно автономными, но сохранившими зависимость от клеток.