Электрический пробой внутренней мембраны митохондрий

Как известно, в присутствии субстратов энергии и кислорода происходит "энергизация" мембран митохондрий, которая заключается в создании разности электрохимических потенциалов протонов (DmH+) между водными фазами, разделенными внутренней мембраной. Суммарная величина (DmH+) складывается из электрической и осмотической энергии протонов. В свою очередь, (DmH+) создается за счет разности стандартных восстановительных потенциалов переносчиков электронов в точках сопряжения дыхательной цепи. Она была названа Митчеллом протон-движущей силой (PMF). Выраженная в милливольтах, протон-движущая сила дыхательной цепи, как уже говорилось в лекции 2, равна:

PMF (мВ) = 60 (мВ) · DpH + Dj (9)

Где DpH - разность pH, а Dj - разность потенциалов между водными фазами, разделенными внутренней мембраной митохондрий. Чтобы выяснить, может ли разность потенциалов на внутренней мембране митохондрий вызвать электрический пробой этой мембраны, нам нужно, во-первых, научиться изменять потенциал Dj, а во-вторых, научиться его измерять. Начнем с первой задачи. Из уравнения 9 видно, что можно изменять мембранный потенциал Dj, если варьировать DpH. В свою очередь, довольно очевидно, что изменять DpH на мембране митохондрий можно, добавляя к этим органеллам анион, который проникает через мембрану в форме недиссоциированной кислоты, а затем, диссоциируя в матриксе митохондрий, нейтрализует щелочь, образовавшуюся при энергизации митохондрий, т.е., иначе говоря, снимает DpH. Таким анионом может служить ацетат, поскольку уксусная кислота легко проходит через фосфолипидный слой мембран. Добавляя к митохондриям разное количество ацетата, можно постепенно снижать DpH и, тем самым, дозировано увеличивать Dj. С другой стороны, уже довольно давно известен метод измерения мембранного потенциала в митохондриях, основанный на измерении флуоресценции некоторых зондов, таких, например, как цианиновый краситель dis-S₃(5), впервые примененный для этой цели Ларисом и сотрудниками в 1975 году. Будучи катионом, зонд входит внутрь митохондрий, где потенциал отрицательный, и там его флуоресценция тушится. В наших исследованиях электрического пробоя мембран митохондрий, прежде всего, была проведена "калибровка" зонда. Для этого деэнергизованные митохондрии помещали в изотонические растворы, содержащие переносчик калия, антибиотик валиномицин, и разные концентрации ионов калия. Затем, измерив флуоресценцию dis-S₃(5) во всех этих растворах, строили график зависимости флуоресценции зонда от рассчитанного по уравнению Нернста калиевого диффузионного потенциала. Получалась практически прямая линия. Этот график в последующих опытах был использован для расчетов мембранного потенциала в митохондриях, находящихся в различных состояниях, на основании измерения флуоресценции зонда dis-S₃(5). Результат одного из опытов показан на рис. 12. На рисунке хорошо видно, что при потенциале на мембране не выше 200 мВ этот потенциал стабилен, т.е. во времени не изменяется. Если же, добавив больше ацетата, создать еще более высокий (по абсолютной величине) потенциал на митохондриальной мембране, то возникший потенциал не держится, а начинает падать со скоростью, которую показывает tga на правой кривой рисунка 12. Зависимость tga от концентрации добавленного ацетата и мембранного потенциала показана на рисунке 13. Как можно видеть на рис. 13, при потенциале на мембране выше 200 мВ, по-видимому, наступает электрический пробой, что сопровождается падением мембранного потенциала и ростом флуоресценции зонда.