Методы биофизики

"Самый прямой" метод изучения свободных радикалов – метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). По наличию, амплитуде и форме сигналов (спектров) ЭПР можно судить о существовании непарных электронов в образце, определять их концентрацию, а иногда и выяснить, какова химическая структура радикалов, которые эти непарные электроны содержат. К прямым методам изучения радикалов можно отнести также метод хемилюминесценции (ХЛ). При взаимодействии радикалов друг с другом выделяется много энергии, которая в некоторых случаях испускается в виде фотонов (квантов света). Интенсивность такого свечения (ХЛ) пропорциональна скорости реакции, в которой участвуют радикалы и, следовательно – их концентрации. Надо отметить, что при всех достоинствах этих методов, в особенности метода ЭПР, их чувствительности оказывается зачастую недостаточной. В биологических системах скорости образования радикалов кислорода или липидных радикалов в мембранах не так уж велики, зато очень велики скорости исчезновения этих радикалов; поэтому концентрация радикалов в каждый данный момент времени (так называемая стационарная концентрация) зачастую так мала, что обнаружить их непосредственно методом ЭПР невозможно. Выход из положения заключается в том, что активные радикалы переводятся в неактивные, стабильные, которые регистрируются с помощью ЭПР [1], стр. 24-28). С этой целью к изучаемому образцу (например, к суспензии клеток, гомогенату ткани или раствору, где протекают реакции с участием свободных радикалов) добавляют особые вещества, называемые спиновыми ловушками (хотя "ловят" они, конечно не спины, а радикалы). Например, для "улавливания" радикалов гидроксила HO· используют фенилбутилнитрон (ФБН) (см. рис. 1). При взаимодействии ловушки с радикалом происходит присоединение радикала к ловушке с образованием нового, стабильного радикала, получившего название "спинового аддукта" (от английского слова add – добавлять, складывать). Сигналы ЭПР спиновых аддуктов разных радикалов слегка различаются по форме. Это позволяет идентифицировать радикалы, образующиеся в изучаемой системе. Для улавливания других радикалов (скажем, супероксида) используют другие ловушки. Поскольку спиновая ловушка "перехватывает" свободные радикалы, она тормозит (ингибирует) тот процесс, который этими радикалами вызывается, например, уменьшает повреждение живых клеток радикалами HO·. Таким образом, спиновые ловушки используются в двух целях: чтобы выяснить, какие радикалы образуются и какие процессы в клетке они вызывают.

Рис.1.

Схема реакции спиновой ловушки (ФБН) и радикала гидроксила

Какие радикалы образуются в наших клетках и тканях?

Согласно предложенной нами классификации, все радикалы, образующиеся в нашем организме, можно разделить на природные и чужеродные. В свою очередь природные радикалы можно разделить на первичные (полезные), вторичные (повреждающие) и третичные (радикалы антиоксидантов) (см. схему на рис. 2 и таблицы 1 и 2). Образование первичных радикалов осуществляется при участии определенных ферментных систем; эти радикалы выполняют полезные для организма функции. Из первичного радикала – супероксида, а также в результате других реакций в организме могут образоваться весьма активные молекулярные соединения: перекись водорода, гипохлорит и гидроперекиси липидов. Под действием ионов металлов переменной валентности, в первую очередь – ионов Fe2+, из этих веществ образуются вторичные свободные радикалы, такие как радикал гидроксила и радикалы липидов, которые оказывают разрушительное действие на клеточные структуры (таблица 2).

Таблица 1. Первичные радикалы, образующиеся в нашем организме

Таблица 2. Вторичные радикалы

Перечисленные в таблицах 1 и 2 радикалы можно считать природными, поскольку они в определенном количестве всегда образуются в наших клетках. Наряду с этими радикалами разрушительное действие могут оказывать радикалы, появляющиеся при таких воздействиях, как ионизирующее излучение, ультрафиолетовое облучение или даже освещение интенсивным видимым светом, например, светом лазера. Такие радикалы можно назвать чужеродными. К ним принадлежат также радикалы, образующиеся из попавших в организм посторонних соединений, ксенобиотиков, многие из которых оказывают токсическое действие именно благодаря свободным радикалам, образующимся при метаболизме этих соединений.