Некоторых других видов рода

Таблица 39 - Дифференцирующие признаки В. anthracis и

Таблица 39 (продолжение)

Виды В. megaterium и В. mesentericus объединены в один вид — В. megaterium; В, anthracoides и
В. pseudoanthracis отнесены к В. cereus.

Идентификация В. anthracis при помощи сибиреязвенного бактериофага (К-ВИЭВ, Гамма MB A, Fah - ВНИИВМ). Используют для идентификации выделенных чистых культур возбу­дителя или непосредственно в первичных посевах. В первом случае испытуемую культуру концентрацией 125-500 млн м.к./мл засевают на шесть пробирок со скошенным МПА (без конденсата) равномерно по всей поверхности среды, выдерживают посевы 15 минут при 37° С. Далее в 4 пробирки вносят по одной капле неразведенного фага и ставят их в штатив до стекания капель. В две пробирки фаг не вносят (контроль). Исследование можно проводить в чашках Петри с предва­рительно подсушенным агаром, разделенным по три квадрата в трех горизонтальных полосах. На три квадрата наносят исследуемую куль­туру (материал) бактериологической петлей, подсушивают пять минут. Затем на два квадрата наносят неразведенный бактериофаг, третий служит контролем. Посевы инкубируют при 37°С 6-18 часов. Для идентификации возбудителя в первичных посевах аналогичным спосо­бом на МПА засевают исследуемый материал и далее поступают, как описано выше.

Учет результатов проводят через 6-8 и 12-18 часов. В контроле дол­жен быть сплошной рост культуры по всей поверхности среды. Положи­тельным результатом является стерильная «дорожка» по ходу стекания кап­ли фага или отсутствие роста в квадрате с фагом.

Обнаружение антигенов В. anthracis в патологическом материале при помощи реакции преципитации. Только в РП исследуют загнивший материал. Если доставленное ухо обескровленно, исследуют и свежий материал.

Свежий тканевый материал перед исследованием выдерживают 18-20 часов в термостате, несвежий исследуют сразу.

Способы экстрагирования растворимых антигенов В. anthracis.

ируют при 20°С в течение 16—Горячий способ. 1-2 грамма ткани заливают в соотношении 1:10 0,9%-нымраствором натрия хлорида и кипятят в водяной бане 30-40 минут.

Холодный способ. 1-2 грамма материала растирают в ступке с песком, заливают фенолизированным (0,3% фенола) физиологическим раствором в соотношении 1:10 и экстрагируют при 20°С в течение 16-18 часов. Экст­ракты фильтруют через асбестовую вату и исследуют как антиген в реак­ции кольцепреципитации методом наслаивания или подслаивания.

Метод наслаивания. В уленгутовскую пробирку вносят 0,2-0,3 мл преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, затем осторожно наслаива­ют экстракт, чтобы оба компонента не перемешались.

Метод подслаивания. В уленгутовскую пробирку вносят 0,2-0,3 мл исследуемого экстракта. Под него при помощи пастеровской пипетки подслаивают равный объем иммунной сыворотки. Контроль: анало­гичным образом ставят РП с преципитирующей сывороткой и стандарт­ном сибиреязвенным антигеном. Положительный результат — наличие беловатого тонкого диска преципитации на границе компонентов в опыте и контроле через 1-2 минуты, но не позднее 15. Положительный результат РП является достаточным основанием для положительного диагноза на сибирскую язву.

Обнаружение антигенов В. anthracis в кожевенно-меховом сырье про­водят в соответствии с «Наставлением по исследованию кожевенного и мехового сырья на сибирскую язву реакцией преципитации».

Питательные среды. Среда ГКИ. К раствору Хенкса добавляют 40% (объем/объем) стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота, инактивированной при 56°С 30 минут. Раствор Хенкса можно заменить бульоном Хоттингера (рН 7,2-7,4). Среду используют для обнаружения способнос­ти капсулообразования у В. anthracis.

Среда Томова. В состав среды входят: 50 мл пептонного агара (10%-ный раствор агара, 2,5%-ный раствор пептона, 0,5%-ный раствор натрия хлорида), 100 мл сыворотки крови крупного рогатого ско­та, 50 мл куриного белка, 25 мл 0,4% гемина в 0,01 N растворе натрия гидроксида, 25 мл 0,01 N уксусной кислоты. В стерильной колбе смешивают сыворотку крови, белок подогревают до 50°С и добавляют к расплавлен­ному пептонному агару, имеющему температуру 50°С. Затем добавляют раствор гемина, уксусную кислоту, компоненты перемешивают и стериль­но разливают в чашки Петри. На данной среде возбудитель сибирской язвы растет в
S- или SM-форме.

Среда обладает селективными свойствами: растут В. anthracis, В. cereus; не растут В. subtilis, B.megaterium, В. brevis, В. mycoides.

Среда Kniesely. К расплавленному питательному агару добавля­ют
40 мкг/мл лизоцима, 30 ЕД/мл полимиксина, 300 мкг/мл натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 40 мкг/мл таллия ацетата. Растворы предварительно стерилизуют фильтрацией, устанавливают рН 7,35. Через 24-48 ч инкубирования при 37° С В. anthracis вырастает в виде мелких, гладких колоний.

Другие виды бацилл на этой среде обычно не растут. ЭДТА и ацетат таллия можно вносить в среду до автоклавирования.

Лизоцимовая среда. Первоначально гото­вят раствор лизоцима, содержащий 10000 ЕД в дистиллированной воде, стерилизуют фильтрацией.
1 мл раствора лизоцима смешивают с 99 мл стерильного питательного бульона и разливают по 2,5 мл в пробирки. При изучении бацилл, патогенных для насекомых, 1 мл лизоцимового раствора (0,1%) смешивают с 99 мл полужидкого агара, который готовят следующим образом. В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г агара, 3 г Na₂HP0₄, по 5 г дрожжевого экстракта и триптона; фильтруют, устанавливают рН 7,3-7,5 и стерилизуют при 121° С 20 мин. Затем стерильно добавляют раствор глюкозы из рас­чета 2 г/л. Глюкозу предварительно стерилизуют в виде 10%-ного раствора при 115° С 20 минут. Используют для идентификации видов рода Bacillus.

Дифференциально-диагностическая среда с фенолфталеинфосфатом натрия. К 100 мл питательного агара, расплавленного и имеющего температуру 45-50° С, добавляют следующие растворы: 0,5 мл полимиксина М суль­фата, 0,5 мл невиграмона, 10 мл гризеофульвина, 10 мл моющего средства «Прогресс», 0,1 мл натрия фенолфталеинфосфата. Компоненты перемеши­вают, разливают в чашки Петри. Среда пригодна 1-2 сут. при хранении в условиях холодильника.

Через 18-24 ч культивирования посевов в крышку чашки Петри вно­сят 1-2 мл 25%-ного водного раствора аммиака. Чашку выдерживают (крышкой вниз) при 20° С 1 минуту и учитывают результат. Колонии бакте­рий с фосфатазной активностью розовеют, остальные колонии, в том числе В. anthracis, остаются бесцветными. Среда обладает селективными свой­ствами.

Приготовление растворов. Полимиксина М сульфат растворяют в фи­зиологическом растворе из расчета 10000 ЕД/мл, невиграмон растворяют в 25%-ном водном растворе аммиака, затем разводят стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида до концентрации 100 мкг/мл. Моющее сред­ство «Прогресс» разводят стерильной дистиллированной водой до концен­трации 0,1%. Гризеофульвин растирают в ступке, растворяют в стериль­ной дистиллированной воде до концентрации 100 мкг/мл. Натрия фенолфталеинфосфат (коммерческий 10%-ный раствор) прогревают на водяной бане при 56° С 30 минут.

Среду используют для выделения из загрязненного материала возбуди­теля сибирской язвы.