Культивирование

Выделение и идентификация культуры возбудителя

Микроскопические исследование исходного материала

Бактериологическое исследование

Лабораторная диагностика туляремии

Туляремия — природно-очаговая, факультативно-трансмиссивная инфек­ционная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, увеличением лимфати­ческих узлов, абортами. Возбудитель — грамотрицательная палочковид­ная бактерия Francisella tularensis, относящаяся к роду Francisella. Вид под­разделяется на четыре подвида: novicida, неарктический, среднеазиатский, голарктический. Последний подвид дифференцируют на три биовара: японский, I Erys (эритромицинчувствительный) и II Erys (эритромицинрезистентный).

Наиболее чувствительны к туляремии зайцы, полевки, водяные кры­сы, хомяки, домовые мыши, несколько менее чувствительны суслики, серые крысы. Из сельскохозяйственных животных спорадически забо­левают поросята, ягнята, лошади, крупный рогатый скот, восприимчив человек.

Основным источником возбудителя являются мыши-полевки, домовые мыши, водяные крысы, ондатры, зайцы. Переносчиками возбудителя мо­гут быть иксодовые и гамазовые клещи, комары, москиты. В Европе и Азии наиболее распространен голарктический тип возбудителя. Лабораторная диагностика туляремии базируется на результатах бактериологического исследования.

В лабораторию трупы грызунов направляют целиком, от крупных живот­ных — печень, селезенку, почки, увеличенные лимфатические узлы. Фраг­менты перечисленных органов желательно транспортировать в заморожен­ном виде (-30° С ------------------ -70° С), в случае необходимости можно консервиро­вать в 30%-ном стерильном растворе глицерина.

Из паренхиматозных органов и крови делают мазки, фиксируют метанолом и спирт-эфиром, окрашивают по Граму и Романовскому-Гимза. В по­ложительных случаях в поле зрения обнаруживают грамотрицательные полиморфные, мелкие (0,2x0,2-0,7 мкм) палочковидные бактерии, преимущественно коккобактерии.

При окраске по Граму клетки окрашиваются слабо, интенсивнее — по методу Романовского-Гимза, приобретая красновато-фиолетовый цвет, имеют небольшую капсулу. Ценную дополнительную информацию дает окраска фиксированных препаратов туляремийной люминесцирующей сывороткой прямым или непрямым способом. С положительным результатом апробирована для выявления возбудителя в материале ПЦР.

F. tularensis аэроб, температурный оптимум 36-37° С, рН питательных рH— 6,8-7,3, требователен к питательным средам. На обычных МПА и МПБ возбудитель не растет.

Выделить культуру возбудителя методом прямого посева на питательныe среды удается редко. Обычно исследуемым материалом заражают лабораторных животных и уже потом пытаются выделить F. tularensis из органов заболевшего животного. Возбудитель требует для роста цистеин или цистин.

Материал высевают на свернутую желточную среду Мак-Коя, кровя-ной агар с цистином, среду Френсиса, селективные среды. Материал тща-тельно втирают в поверхность плотных питательных сред, пробки закры-вают резиновыми колпачками. Посевы инкубируют в случае отсутствия роста до 10 суток, обычно макроскопически видимый рост обнаруживается через 2-4 суток.

На среде Мак-Коя возбудитель растет в виде нежного, сочного извили-стого налета («шагреневого») или в виде мелких, нежных изолированных юлоний. На среде Френсиса рост проявляется в виде молочно-белого налета или круглых, диаметром 1-2 мм, с ровными краями, выпуклых, с глад­кой блестящей поверхностью колоний беловатого цвета.

На кровяных средах через 2-4 дня колонии достигают максимального мера, через 48 часов имеют вид сероватых росинок, при дальнейшей инкубации колонии проявляют тенденцию к слиянию и вокруг них появля­ется характерная зеленоватая зона обесцвечивания. Колонии на плотных питательных средах имеют слизистую консистенцию.

В жидких питательных средах возбудитель растет только на поверхнос­ти и в целом хуже, чем на плотных питательных средах.

Практикуется также посев материала в желточный мешок развиваю­щихся 12-дневных куриных эмбрионов.

Морфология клеток F.tularensis в культуре. В окрашенных препаратах из агаровых культур клетки грамотрицательные, чаще кокковидные. В отличие от клеток в животных тканях, в мазках из жидких культур имеют форму изогнутых палочек с закруглен­ными концами, иногда нитей. При специальных методах окраски выяв­ляется капсула. Подвижностью не обладают, но из-за мелких размеров имеют выраженное «броуновское движение».

Идентификация возбудителя на родовом уровне. Франциселлы имеют некоторое морфологическое сходство с рядом грамотрицательных палочковидных бактерий из родов Brucella, Pasteurella, Yersinia. В случае затруднений по определению родовой принадлежности выделенной культуры целесообразно установить, яв­ляются ли бактерии строгими аэробами, требуют ли для своего роста СО₂, что характерно для некоторых видов бруцелл, а также потреб­ность для роста на питательных средах в цистеине или цистине, спо­собность к расщеплению углеводов, образованию оксидазы, каталазы, аммиака в жидкой среде. Принимают во внимание также морфоло­гические и тинкториальные особенности клеток. Для франциселл ха­рактерно слабое восприятие красителей при окраске по методу Грама, очень нежная капсула в отличие от выраженной капсулы у пастерелл и иерсиний (Y. pestis в первую очередь). Франциселлы являются, как и бруцеллы, аэробами. Имеют, в отличие от иерсиний, температурный оптимум 37° С, требуют для роста цистин и цистеин, чем отличаются от бактерий указанных родов. Франциселлы расщепляют углеводы толь­ко на специальных средах с углеводами (среды Гисса не подходят), не образуют оксидазу и аммиак в жидкой среде, чем отличаются от иерси­ний и бруцелл.

Идентификация F.tularensis по культуральным ферментативным и патогенным свойствам на уровне вида и биовара. В первую очередь проверяют способность выделенной культуры к рос­ту на обычных питательных средах (кровяной агар, МПБ, МПА), на кото­рых растет F. novicida, но не растут культуры других биоваров F. tularensis. Также параллельно проводят культивирование выделенной культуры на средах с цистеином или цистином, на агаре Мак-Конки, в МПБ с 6% NaCl. Учитывают размер образующихся колоний, F. tularensis требует для роста цистин и/или цистеин. Исследуют образованиякислоты из мальтозы, сахарозы, глицерина, патогенность для кроликов.