Питательные среды. Серологическая идентификация F.tularensis

Серологическая идентификация F.tularensis

Осуществляют методом флуоресцирующих антител и в реакции агглютинации (основной метод). В качестве экспресс-методов детекции возбудителя в исходном материале используют РИФ, ЭЛИЗА, ПЦР.

При постановке РА используют диагностическую туляремийную иммунную сыворотку. Исследуемую культуру выращивают на среде Мак-Коя в течение 48 часов, бактериальную массу снимают (не смывают!) с поверхности среды и устанавливают концентрацию взвеси 5 млрд. микробных клеток в 1 мл. РА ставят в объеме 1 мл, к каждому разведению сыворотки в объеме 0,5 мл добавляют 0,5 мл микробной взвеси. Пробирки выдерживает 2 часа при 37° С и 20-22 часа при комнатной температуре. Культура туляремийного микроба должна агглютинироваться диагностической сывороткой не менее чем на 2/3 ее титра. Сыворотка против F.novicida агглютинирует только F.novicida.

Таблица 69 - Критерии дифференциации подвидов F. tularensis¹

Тесты	подвид неарктический	подвид голарктический	подвид novicida
Рост на простых средах	-	-	+
Потребности в цистине или цистеине	+	+	-
Рост на среде Мак-Конки	-	-	варьирующий показатель
Размер колоний на кровяном агapе с глюкозой и цистином (5 м в диаметре)	-	-	+
Образование кислоты из:
сахарозы	-	-	+
глицерина	+	-	+
мальтозы	+	+	-
Рост в МПБ с 6% NaCl	-	-	варьирующий показатель
DLM для кроликов при подкожном заражении (менее 1000 клеток)	+	-	-

Биопроба. Проводят с целью выделения культуры возбудителя из исследуемого мате риала и проверки патогенных свойств выделенной культуры.

Для заражения используют белых мышей и морских свинок. Мыши погибают раньше морских свинок, у морских свинок легче выявить характерные патолого-анатомические изменения в органах.

Исследуемый материал растирают в ступке с небольшим количеством стерильного физиологического раствора и вводят подкожно белым мышл м в дозе 0,3-0,5 мл, морским свинкам — 1-2 мл. При наличии возбудител я и в зависимости от его количества мыши погибают на 3-9-е сутки, морс кие свинки — на 4-15-е сутки. Выживших мышей убивают на 15-е сутки, морских свинок — на 25-е сутки после заражения. Материал от животны n подвергают микробиологическому исследованию.

Гидролизаты печени и крови готовят без предварительной температурной обработки для сохранения витаминов.

Свернутая желточная среда Мак-Коя и Чепииа (желток 60%,
физиологический раствор 40%)

Дистиллированную воду для физиологического раствора необходимо подщелочить до рН 7,0-7,2 (зеленый цвет с бромтимоловым синим). И целях более надежной стерилизации свертывание проводят при 80° С в течение часа. Добавляют аутолизат пивных дрожжей перед свертыванием среды из расчета: на 60% желтка 20% аутолизата и 20% физиологического раствора.

Агар на рыбно-дрожжсвом гидролизате. К 100 мл дистиллированной воды добавляют гидролизата свежей рыбы — 20 мл, гидролизата желатины — 10 мл, аутолизата дрожжей -2,5 мл, хлористого натрия — 0,5 г, глюкозы — 1 г, цистина — 0,1 г, агар-агара в зависимости от его качества от 1,5 до 2,5 г. После стерилизации в расплавленную среду, охлажденную до 45° С, добавляют 10% дефибрини-рованной крови кролика, разливают в пробирки и скашивают либо разливают в чашки Петри.

Мартеновский дрожжевой агар. Мартеновского бульона — 930 мл, дрожжевого аутолизата — 70 мл, глюкозы — 10 г, цистина — 1 г, хлористого калия — 0,4 г, хлористого натрия — 3 г, двууглекислой соды —
0,1 г, сернокислого магния -0,3 г, двуосновного фосфорнокислого натрия — 0,8 г, едкого натра 5% (раствор добавлять до рН 7,2 -7,4), агар-агара —
30 г.

Дрожжевой аутолизат готовят впрок по следующему рецепту. Пивные дрожжи отмывают от сусла водопроводной водой в высоких цилиндрах, воду сменяют 3-4 раза. Аутолиз проводят при 56-58° С в течение суток. На следующий день аутолизат кипятят на открытом огне в течение 20 минут, затем подщелачивают едким натром по лакмусу до слабощелочной реакции и разбавляют водой: на 1 часть аутолизата добавляют 2 части воды. После этого аутолизат вновь кипятят 40 минут и затем фильтруют через бумажный фильтр, стерилизуют в автоклаве 30 минут при 120° С. Простерилизованный аутолизат сохраняется длительный срок.

Полужидкая (коллоидная) среда Дрожевкиной. 10% куриных желтков и 90% стерильного физиологического раствора, а не выдерживает стерилизации.

Полужидкие среды применяют для выращивания вакцинной культуры. В состав сред входят гидролизаты свежей рыбы, печени или мяса — 20-30%, гидролизат желатины — 10%, дрожжевой аутолизат — 1 -5%, желатины — 1,5%, хлористый натрий — 0,5%, глюкоза — 1%, цистин —0,1%; рН среды 7,2-7,3. Все гидролизаты получают путем ферментативного переваривания при добавлении поджелудочной железы или
панкреатина. Гидролиз ведут до получения аминного азота от 600 до 800

мг%.

Среда Френсиса. К МПА с 1% пептона и 0,5% NaCl (рН 7,3) добавляют 0,1% цистина и глюкозы. Сразу кипятят несколько минут, охлаждают до 50° С и вносят 10% дефибринированной крови кролика.

Селективная среда Тейера—Мартина. Агар (BBL) — 38 г, мясной экстракт — 300 г; пептон (BBL) —17,5 г; крахмал — 1,5 г; агар — 17 г; дистилированная вода — 1000 мл. Среду разливают по 25 мл в колбы, автоклавируют 15 минут при 121° С, охлаждают до50°С, добавляют в каждую колбу по 0,25 мл смеси антибиотиков V-C-N Jnibitor (BBL) (ванкомицин, колистин, нистатин), размешивают, разливают по чашкам Петри. На данной среде можно выделить F.tularensis из смешанной культуры.

Среда для выделения F.tularensis (г/л). Триптазный бульон с тиамином (Difco) —20,0; солянокислый цистеин — В; натрия тиоглюконат — 2,0; глюкоза —10,0; агар — 10; смешивают все МПоненты, кроме агара, устанавливают рН 7,2, добавляют агар и расплавляют, автоклавируют при 121° С в течение 20 минут, охлаждают до 45-48° С, добавляют 50 мл дефибринированной крови кролика и разливают в шпики Петри.

Пептон-цистеиновый агар (г/л). Бакто-пептон (Difco)—20,0, натрия хлорид — 10,0, глюкоза — 1,0, солянокислый цистеин — 1,0, агар — 20,0; смешивают компоненты кроме агара, устанавливают рН 6,8, добавляют агар, кипятят, охлаждают до 45-48° С и разливают в чашки Петри.

Среда с цистеином для изучения сахаролитической активности Francisella. Состав среды. Раствор А: бакто-пептон — 10 г, мясной экстракт — 1,5 г, хлористый натрий — 5 г, цистеин НС1 — 1 г, дистилированная вода — 500 мл, рН 7,2. Раствор Б: агар — 15 г, расплавленный в 500 мл дистиллированной воды. Смешивают растворы А и Б, добавляют
2 мл 1,5%-ного водного раствора фенолового красного (1,5 г фенолрота растворяют в 5 мл 0,1 N NaOH и добавляют 95 мл воды). Среду стерилизуют при 121° С в течение 20 минут и добавляют тот или иной стерилизованный фильтрованием углевод до конечной концетрации 1%, разливают по 5 мл в пробирки и смешивают. При исследовании сахаролистических свойств испытуемую культуру засевают на поверхность среды в большом количестве бактериологической петлей.

Лабораторная диагностика пастереллёза

Пастереллез — болезнь многих сельскохозяйственных, диких животных и птиц. Возбудителями пастереллеза являются различные виды бактерий рода Pasteurella, семейства Pasteurellaceae. Патогенные свойства доказаны не у всех пастерелл, наибольшее значение в патологии животных имеют следующие виды.

P. multocida серовара В является первичным возбудителем геморрагической септицемии различных видов жвачных животных. P. multocida серовара D обусловливает, обычно как вторичный агент, пневмонии и атрофический ринит свиней. P. miltocida серовара А у крупного рогатого скота участвует в развитии пневмонии телят, иногда — маститов коров, у овец этот серовар пастерелл является причиной пневмоний и маститов, у свиней — пневмоний (часто как первичный агент), у кроликов — плевропневмоний (заразного насморка), генитальных инфекций, у птицы — «холеры» (первичная инфекция). P. multocida серовара Е является этиологическим агентом эпизоотической геморрагической септицемии крупного рогатого скота и буйволов в Африке. У индеек изолирована P. multocida типа F, но ее этиологическая роль до сих пор не выяснена.

P. haemolytica биотипа А известна как первичный или вторичный агент пневмоний, учавствует в развитии синдрома «транспортной лихорадки» крупного рогатого скота. P. haemolytica биотипа Т вызывает септицемию ягнят 5-12-месячного возраста. У свиней в кишечном тракте обитает P. aerogenes, которую иногда выделяют при абортах данного вида животных.

P. anatipestifer рассматривают как возбудитель фибринозного полисерозита у 1-8-недельных уток. У лошадей респираторную патологию, включая пневмонию, может обуславливать Р. caballi. Роль ряда видов пастерелл в патологии животных на данное время не доказана.