Уравнение Михаэлиса-Ментен. Кинетика ферментативных процессов

Кинетика ферментативных процессов

Катализатор – вещество, которое ускоряет реакцию, но само оно в ней не расходуется. Реакции, катализирующиеся ферментами, обычно характеризуются сильным ускорением (порядка 10⁴ – 10⁵ раз) и высокой специфичностью. Под специфичностью понимают способность ферментов ускорять реакцию только между определенными веществами, которые называются субстратами.

Все ферменты представляют собой белковые молекулы, которые содержат один или несколько активных центров, где и происходит превращение субстратов. Структура активного центра может быть образована всего несколькими аминокислотными остатками. Остальная часть белковой молекулы необходима для поддержания структурной целостности этой рабочей части – активного центра.

При изучении кинетики ферментативных процессов обычно измеряют начальные скорости реакции. Это достигается путем изменения только концентрации субстрата, тогда как все остальные условия опыта поддерживаются постоянными. Для реакций, в которых участвует несколько субстратов, должны также поддерживаться постоянными концентрации всех субстратов, кроме одного. Преимущество такого подхода состоит в том, что при этом не возникает осложнений, зависящих от подавления активности фермента продуктами реакции, изменением конформации фермента, рН среды и температуры, а также возможной обратимостью реакции. На рис. 1.1 показан график зависимости начальных скоростей от концентрации субстрата.

Рис. 1.1. График зависимости начальной скорости реакции υ_О от концентрации субстрата [S].

В 1913 г. Михаэлисом и Ментен была предложена теория, объясняющая зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. Они рассмотрели следующую схему процесса:

где: E и S – фермент и субстрат соответственно; ES – фермент-субстратный комплекс, Р – продукт реакции. Начальная скорость υ_О образования продукта дается уравнением:

d[P]

υ_О = ——— = k₂ ∙ [ES]. (1.2)

dt

Концентрацию фермента и субстрата в любой момент времени t после начала реакции можно представить в виде:

[E] = [E]_О − [ES]; [S] = [S]_О – [ES],

где: [E]_О и [S]_О - начальные концентрации фермента и субстрата соответственно, [ES] – концентрация фермент-субстратного комплекса.

Однако, условия опыта обычно таковы, что [S]_О >> [E]_О, поэтому [S]_О >> [ES] или [S] ≈ [S]_О. Михаэлис и Ментен предположили, что k₋₁ >> k₂, так что первая стадия (образование комплекса ES) может рассматриваться как процесс быстрого установления равновесия. Константа диссоциации К_S записывается в виде:

k₋₁ [E] ∙ [S] ([E]_О − [ES]) ∙ [S]

К_S = —— = ———— = ————————. (1.3)

k₁ [ES] [ES]

Решая это уравнение относительно [ES], получаем

[E]_О ∙ [S]

[ES] = ——————. (1.4)

К_S + [S]

Подстановка последнего уравнения в уравнение для начальной скорости реакции (υ_О), дает следующее выражение:

d[P] k₂ ∙ [E]_О ∙ [S]

υ_О = ——— = ———————. (1.5)

dt К_S + [S]

График зависимости υ_О от [S] представляет собой гиперболу, похожую на кривую, изображенную на рис. 1.1.

Из изложенного ясно, что предположения, использованные Михаэлисом и Ментен, должны выполняться лишь в немногих случаях. Как правило, оказывается, что величина k₂ сопоставима или даже превышает величину k₋₁.

В связи с этим, другие авторы Бриггс и Холдейн в 1925 г. Предложили подход, независящий от относительных величин k₋₁ и k₂. Они применили к процессу, в котором участвует фермент-субстратный комплекс, стационарное приближение.

Согласно данному приближению концентрация фермент-субстратного комплекса не изменяется во времени, то есть d[ES] / dt = 0. Из этого следует:

d[ES]

——— = 0 = k₁ ∙ [E] ∙ [S] − k₋₁ ∙ [ES] − k₂ ∙ [ES] =

dt

= k₁ ∙ ([E]_О − [ES]) ∙ [S] − (k₋₁ + k₂) ∙ [ES]. (1.6)

Решая уравнение относительно [ES], получаем:

k₁ ∙ [E]_О ∙ [S]

[ES] = ———————.

k₁ ∙ [S] + k₋₁ + k₂

Используя последнее уравнение и уравнение для нахождения υ_О, получаем:

d[P] k₁ ∙ k₂ ∙ [E]_О ∙ [S] k₂ ∙ [E]_О ∙ [S]

υ_О = ——— = k₂ ∙ [ES] = ———————— = ————————— =

dt k₁ ∙ [S] + k₋₁ + k₂ [(k₋₁ + k₂) / k₁] + [S]

k₂ ∙ [E]_О ∙ [S]

= ———————, (1.7)

K_m + [S]

где: K_m – константа Михаэлиса, которая определяется следующим образом:

k₋₁ + k₂

K_m = ————. (1.8)

k₁

Сравнивая уравнения для нахождения величин υ_О и K_m, можно видеть, что они содержат одинаковую зависимость от концентрации субстрата, однако в общем случае K_m ≠ К_S. Равенство выполняется только при k₋₁ >> k₂.

В кинетических исследованиях оказывается полезной величина максимальной скорости реакции υ_m. Это такая скорость, с которой реагируют молекулы фермента, находящиеся в составе комплекса ES, то есть при равенстве [E]_О = [ES]. Из уравнения (1.2) находим:

d[P]

υ_О = ——— = k₂ ∙ [ES], из этого

dt

υ_m

следует, что υ_m = k₂ ∙ [E]_О или [E]_О = ———.

k₂

Подставляя [E]_О в уравнение (1.7), получаем уравнение Михаэлиса – Ментен:

υ_m ∙ [S]

υ_О = ————. (1.9)

K_m + [S]

Уравнение (1.9) имеет два предельных случай. При низкой концентрации субстрата K_m >> [S] и скорость описывается уравнением первого порядка относительно [S]:

υ_m ∙ [S]

υ_О ≈ ————. (1.10)

K_m

При высокой концентрации субстрата [S] >> K_m скорость реакции имеет нулевой порядок относительно [S]: υ_О ≈ υ_m.

Эти два случая относятся и к начальной фазе, и к последующим периодам времени для кривой, приведенной на рис. 1.1. Из этого графика можно также получить величину K_m, поскольку при υ_О = υ_m / 2 уравнение (1.9) дает

υ_m υ_m ∙ [S]

—— = ———— или K_m = [S]. (1.11)

2 K_m + [S]